Perbandingan dan Fitur Mikroskop Fluoresensi dan Mikroskop Optik Konvensional
Mikroskop fluoresensi berbeda dari mikroskop optik biasa. Alih-alih mengamati spesimen di bawah penerangan sumber cahaya konvensional, ia menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (biasanya sinar ultraviolet atau biru-ungu) untuk merangsang zat fluoresen di dalam spesimen, menyebabkan zat tersebut memancarkan fluoresensi. Oleh karena itu, sumber cahaya mikroskop fluoresensi tidak berfungsi untuk penerangan langsung; ia bertindak sebagai sumber energi untuk merangsang zat fluoresen endogen dalam spesimen. Kita dapat mengamati spesimen bukan karena pencahayaan dari sumbernya, tetapi karena fluoresensi yang dipancarkan oleh zat fluoresen dalam spesimen setelah menyerap cahaya eksitasi.
Oleh karena itu, ciri utama mikroskop fluoresensi adalah sumber cahayanya, yang dapat menyuplai cahaya eksitasi berlimpah dalam rentang panjang gelombang tertentu untuk memberikan intensitas eksitasi yang cukup untuk zat fluoresen dalam benda uji. Sedangkan mikroskop fluoresensi harus dilengkapi dengan sistem filter yang sesuai. Sebagai alat penting untuk histokimia fluoresensi, alat ini terutama terdiri dari sumber cahaya bertekanan sangat tinggi, satu set filter (termasuk filter eksitasi dan filter penghalang), sistem optik, dan sistem fotografi. Ia bekerja dengan menarik spesimen dengan cahaya dengan panjang gelombang tertentu untuk menghasilkan fluoresensi.
Metode eksitasi fluoresensi: Diklasifikasikan berdasarkan rentang panjang gelombang menjadi eksitasi UV (metode iluminasi ultraviolet) dan eksitasi BV (metode cahaya biru-ungu). Eksitasi UV menggunakan sinar ultraviolet dekat yang lebih pendek dari 400 nm untuk eksitasi. Tidak ada cahaya eksitasi tampak yang terlibat, sehingga fluoresensi yang diamati menunjukkan fluoresensi yang melekat pada pewarna. Hal ini memudahkan untuk membedakan fluoresensi spesifik pada spesimen dari autofluoresensi jaringan latar belakang.
Metode eksitasi BV: Eksitasi dilakukan dengan cahaya mulai dari ultraviolet hingga cahaya biru, berpusat pada 404 nm dan 434 nm. Karena cahaya biru menyinari spesimen dalam metode ini, filter pemutus sistem pengamatan fluoresensi harus sepenuhnya memblokir cahaya biru sambil mentransmisikan fluoresensi hijau dan kuning yang diperlukan sepenuhnya. Metode ini diterapkan pada fluorokrom yang digunakan dalam teknik antibodi fluoresen. Panjang gelombang serapan maksimum dari cahaya eksitasi dan panjang gelombang emisi maksimum fluoresensi relatif dekat, sehingga diperlukan filter tajam untuk eksitasi BV. Cahaya biru digunakan sebagai cahaya eksitasi di sini, yang menghasilkan efisiensi penyerapan fluorokrom yang tinggi dan menghasilkan gambar yang lebih terang. Kelemahannya adalah fluoresensi di bawah 500 nm tidak dapat dideteksi, dan sinyal di atas 500 nm memberikan warna kuning pada keseluruhan gambar. Dalam uji antibodi fluoresen, spesifisitas sebagian besar dinilai berdasarkan karakteristik warna fluorokrom. Oleh karena itu, ketika mengevaluasi spesifisitas halus, kelemahan metode eksitasi BV di atas dapat memiliki dampak yang signifikan.
