Mikroskop fluoresensi dua foton memiliki banyak keuntungan:
1) Cahaya dengan panjang gelombang yang lebih panjang kurang terpengaruh oleh hamburan dibandingkan cahaya dengan panjang gelombang yang lebih pendek untuk menembus spesimen;
(2) Molekul fluoresen di luar bidang fokus tidak tereksitasi sehingga lebih banyak cahaya eksitasi yang mencapai bidang fokus, sehingga cahaya eksitasi dapat menembus lebih dalam ke dalam spesimen;
3) Cahaya inframerah-dekat dengan panjang gelombang yang lebih panjang kurang beracun bagi sel dibandingkan dengan panjang gelombang yang lebih pendek;
4) Saat menggunakan mikroskop dua foton untuk mengamati spesimen, photobleaching dan fototoksisitas hanya terjadi pada bidang fokus. Oleh karena itu, mikroskop dua foton lebih cocok daripada mikroskop foton tunggal untuk mengamati spesimen tebal, untuk mengamati sel hidup, atau untuk melakukan eksperimen pemutihan foto titik.
Pengetahuan mikroskop fluoresensi confocal
Prinsip dasar mikroskop fluoresensi confocal: sumber cahaya titik digunakan untuk menyinari spesimen, membentuk titik cahaya kecil yang jelas pada bidang fokus. Fluoresensi yang dipancarkan dari titik ini setelah iradiasi dikumpulkan oleh lensa objektif dan dikirim kembali ke beamsplitter yang terdiri dari cermin kromatik dua arah di sepanjang jalur cahaya iradiasi asli. Pemisah berkas mengirimkan fluoresensi langsung ke detektor. Baik sumber cahaya maupun detektor masing-masing memiliki lubang jarum di depannya, masing-masing disebut lubang jarum iluminasi dan lubang jarum pendeteksi. Keduanya mempunyai geometri yang sama, sekitar 100-200 nm, dan terkonjugasi terhadap titik cahaya pada bidang fokus, yaitu titik cahaya melewati serangkaian lensa dan pada akhirnya dapat difokuskan pada kedua titik iluminasi. dan lubang kecil detektor. Dengan cara ini, cahaya dari bidang fokus dapat berkumpul di dalam bukaan probe, sementara cahaya yang tersebar dari atas atau bawah bidang fokus terhalang di luar bukaan probe dan tidak dapat dicitrakan. Laser memindai sampel titik demi titik, dan tabung pengganda foto setelah mendeteksi lubang jarum juga memperoleh gambar confocal dari titik cahaya yang sesuai titik demi titik, yang diubah menjadi sinyal digital dan dikirimkan ke komputer, dan akhirnya menyatu menjadi sinyal jernih. gambar confocal dari seluruh bidang fokus di layar.
Setiap gambar bidang fokus sebenarnya merupakan penampang optik dari spesimen, dan penampang optik ini selalu memiliki ketebalan tertentu, disebut juga lembaran optik. Karena intensitas cahaya pada titik fokus jauh lebih besar dibandingkan pada titik non-fokus, dan cahaya bidang non-fokus disaring oleh lubang jarum, kedalaman bidang sistem confocal diperkirakan nol, dan pemindaian sepanjang arah sumbu Z memungkinkan tomografi optik membentuk irisan optik dua dimensi dari spesimen untuk diamati pada titik fokus. Menggabungkan pemindaian bidang XY (bidang fokus) dengan pemindaian sumbu Z (sumbu optik), gambar tiga dimensi dari sampel dapat diperoleh dengan mengumpulkan lapisan gambar dua dimensi yang berurutan, yang diproses oleh perangkat lunak komputer khusus.
Artinya lubang jarum pendeteksi dan lubang jarum sumber cahaya selalu terfokus pada titik yang sama, sehingga fluoresensi yang tereksitasi di luar bidang fokus tidak dapat masuk ke lubang jarum pendeteksi.
Prinsip kerja laser confocal secara sederhana diungkapkan bahwa ia menggunakan laser sebagai sumber cahaya, berdasarkan pencitraan mikroskop fluoresensi tradisional, perangkat pemindaian laser tambahan, dan perangkat pemfokusan konjugasi, melalui kontrol komputer untuk melakukan akuisisi gambar digital dan sistem pemrosesan.
