Metode pengamatan utama mikroskop optik adalah pengamatan fluoresensi
Fluoresensi mengacu pada proses di mana zat fluoresen memancarkan cahaya dengan panjang gelombang yang lebih panjang hampir bersamaan ketika disinari dengan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (Gambar 1). Ketika cahaya dengan panjang gelombang tertentu (panjang gelombang eksitasi) menyerang molekul, seperti pada fluorofor, energi foton diserap oleh elektron molekul. Selanjutnya, transisi elektron dari keadaan dasar (S0) ke tingkat energi yang lebih tinggi, keadaan tereksitasi (S1'). Proses ini disebut eksitasi①. Elektron tetap dalam keadaan tereksitasi selama 10-9–10-8 detik, selama itu elektron kehilangan sejumlah energi②. Selama proses elektron meninggalkan keadaan tereksitasi (S1) dan kembali ke keadaan dasar③, sisa energi yang diserap selama proses eksitasi dilepaskan.
Waktu tinggal molekul fluoresen dalam keadaan tereksitasi adalah masa pakai fluoresensi, yang umumnya pada tingkat nanodetik, dan merupakan karakteristik inheren dari molekul fluoresen itu sendiri. Pencitraan Seumur Hidup Fluoresensi (FLIM), yang menggunakan teknologi pencitraan seumur hidup fluoresensi, disebut pencitraan seumur hidup fluoresensi (FLIM). Selain pencitraan intensitas fluoresensi, pengukuran fungsional dan akurat yang lebih mendalam dapat diperoleh untuk memperoleh konformasi molekuler, interaksi antarmolekul, dan lingkungan mikro molekul. Informasi yang sulit diperoleh dengan pencitraan optik konvensional.
Properti penting lain dari fluoresensi adalah pergeseran Stokes, perbedaan panjang gelombang antara puncak eksitasi dan emisi (Gambar 2). Biasanya panjang gelombang emisi lebih panjang dari panjang gelombang eksitasi. Hal ini karena elektron akan kehilangan sebagian energinya melalui proses relaksasi setelah zat fluoresen tereksitasi dan sebelum melepaskan foton. Zat neon dengan pergeseran Stokes yang lebih besar lebih mudah diamati di bawah mikroskop fluoresensi.
Mikroskopi Fluoresensi dan Kubus Filter Fluoresensi
Mikroskop fluoresensi adalah mikroskop optik yang menggunakan sifat fluoresensi untuk observasi dan pencitraan, dan banyak digunakan dalam berbagai bidang seperti biologi sel, neurobiologi, botani, mikrobiologi, patologi, dan genetika. Pencitraan fluoresensi memiliki keunggulan sensitivitas tinggi dan spesifisitas tinggi, dan sangat cocok untuk pengamatan distribusi protein dan organel spesifik dalam jaringan dan sel, studi kolokalisasi dan interaksi, pelacakan proses dinamis kehidupan seperti perubahan konsentrasi ion , dll.
Sebagian besar molekul dalam sel tidak berpendar, dan untuk melihatnya mereka harus diberi label berpendar. Ada banyak metode pelabelan fluoresen, seperti pelabelan langsung (seperti menggunakan DAPI untuk melabeli DNA), atau pewarnaan imun menggunakan sifat pengikat antigen dari antibodi, atau menggunakan protein fluoresen (seperti GFP, protein fluoresen hijau) untuk melabeli protein target. , dan pengikatan reversibel. Pewarna sintetis (seperti Fura-2) dan seterusnya.
Saat ini, mikroskop fluoresensi telah menjadi peralatan pencitraan standar dari berbagai laboratorium dan platform pencitraan, dan merupakan penolong yang baik untuk eksperimen harian kita. Mikroskop fluoresensi terutama dibagi menjadi tiga kategori: mikroskop fluoresensi tegak (cocok untuk mengiris), mikroskop fluoresensi terbalik (cocok untuk sel hidup, dengan mempertimbangkan pengirisan), stereoskop fluoresen (cocok untuk spesimen yang lebih besar, seperti tumbuhan, ikan zebra (dewasa/embrio ), medaka, organ tikus/tikus, dll.).
Blok filter fluoresensi adalah komponen inti dari pencitraan fluoresensi mikroskop. Ini terdiri dari tiga bagian: filter eksitasi, filter emisi dan pembagi berkas dichroic. Itu dipasang di roda filter. Misalnya, Leica DMi8 dilengkapi dengan 6-roda filter posisi (Gbr. 3 ). Jumlah posisi roda mikroskop yang berbeda akan berbeda, dan beberapa mikroskop menggunakan slide blok filter.
Blok filter memainkan peran penting dalam pencitraan fluoresensi: filter eksitasi memilih cahaya eksitasi untuk merangsang sampel, dan memblokir cahaya dengan panjang gelombang lainnya; cahaya yang melewati filter eksitasi melewati cermin dichroic (fungsinya untuk memantulkan cahaya eksitasi dan mentransmisikan fluoresensi), Setelah refleksi, difokuskan oleh lensa objektif, menyinari sampel, dan membangkitkan fluoresensi yang sesuai, yaitu , memancarkan cahaya. Cahaya yang dipancarkan dikumpulkan oleh lensa objektif, melewati pembagi berkas dichroic, dan mencapai filter emisi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4: panjang gelombang eksitasi adalah 450-490nm, cermin dichroic memantulkan cahaya lebih pendek dari 510nm, mentransmisikan cahaya lebih panjang dari 510nm, dan jangkauan penerimaan cahaya yang dipancarkan adalah 520-560nm.
