Perbedaan antara mikroskop fluoresensi (dua foton, confocal) dan mikroskop biasa
Prinsip dasar eksitasi dua-foton adalah bahwa pada kepadatan foton tinggi, molekul fluoresen dapat secara bersamaan menyerap dua foton panjang gelombang panjang dan memancarkan foton panjang gelombang yang lebih pendek setelah periode singkat yang disebut kehidupan keadaan tereksitasi; Efeknya sama dengan menggunakan foton dengan setengah panjang gelombang panjang gelombang panjang untuk menggairahkan molekul fluoresen. Dua eksitasi foton membutuhkan kepadatan foton yang tinggi, dan untuk menghindari sel yang merusak, mikroskop dua foton menggunakan laser pulsa terkunci mode berenergi tinggi. Laser yang dipancarkan oleh laser ini memiliki energi puncak yang tinggi dan energi rata -rata rendah, dengan lebar pulsa hanya 100 femtoseconds dan frekuensi hingga 80 hingga 100 megahertz. Saat menggunakan lensa objektif aperture numerik tinggi untuk memfokuskan foton laser berdenyut, kepadatan foton pada titik fokus lensa objektif adalah eksitasi tertinggi, dan dua foton hanya terjadi pada titik fokus lensa objektif. Oleh karena itu, mikroskop dua foton tidak memerlukan lubang jarum confocal, yang meningkatkan efisiensi deteksi fluoresensi.
Dalam fenomena fluoresensi umum, karena kepadatan foton yang rendah dari cahaya eksitasi, molekul fluoresen hanya dapat menyerap satu foton pada satu waktu dan kemudian memancarkan foton fluoresen lain melalui transisi radiasi, yang dikenal sebagai fluoresensi foton tunggal. Untuk proses eksitasi fluoresensi menggunakan laser sebagai sumber cahaya, fenomena fluoresensi dua-foton atau bahkan multiphoton dapat terjadi. Dalam hal ini, sumber cahaya eksitasi yang digunakan memiliki intensitas tinggi dan kepadatan foton yang memenuhi persyaratan untuk molekul neon untuk menyerap dua foton secara bersamaan. Dalam proses menggunakan laser umum sebagai sumber cahaya eksitasi, kepadatan foton masih tidak cukup untuk menghasilkan fenomena penyerapan dua foton. Biasanya, laser pulsa femtosecond digunakan, dengan kekuatan instan mencapai tingkat megawatt. Oleh karena itu, panjang gelombang fluoresensi dua foton lebih pendek dari cahaya eksitasi, setara dengan efek yang dihasilkan oleh setengah eksitasi panjang gelombang eksitasi.
Pengetahuan yang terkait dengan mikroskop fluoresensi confocal
Prinsip dasar mikroskop fluoresensi confocal adalah menggunakan sumber cahaya titik untuk menyinari spesimen, membentuk titik cahaya kecil yang terdefinisi dengan baik pada bidang fokus. Fluoresensi yang dipancarkan dari tempat ini setelah iradiasi dikumpulkan oleh lensa objektif dan dikirim kembali di sepanjang jalur iradiasi asli ke splitter balok yang terdiri dari cermin dichroic. Spektrometer mengirimkan fluoresensi langsung ke detektor. Ada lubang jarum di depan sumber cahaya dan detektor, masing -masing disebut lubang jarum iluminasi dan lubang jarum deteksi. Dimensi geometris dari keduanya konsisten, kira -kira 100-200 nm; Dibandingkan dengan titik cahaya pada bidang fokus, keduanya adalah konjugat, yang berarti bahwa titik cahaya melewati serangkaian lensa dan pada akhirnya dapat fokus pada lubang jarum iluminasi dan lubang jarum deteksi secara bersamaan. Dengan cara ini, cahaya dari bidang fokus dapat menyatu dalam kisaran lubang deteksi, sementara cahaya yang tersebar dari atas atau di bawah bidang fokus terhalang di luar lubang deteksi dan tidak dapat dicitrakan. Memindai titik sampel demi titik dengan laser, tabung photomultiplier setelah mendeteksi lubang jarum juga memperoleh gambar confocal yang sesuai dari titik titik cahaya demi titik, mengubahnya menjadi sinyal digital dan mentransmisikannya ke komputer, dan akhirnya menggabungkannya menjadi gambar konfokal yang jelas dari seluruh bidang fokus pada layar.
