Karakteristik teknis dan keterampilan penggunaan mikroskop fluoresensi dua foton
Mikroskopi fluoresensi dua foton adalah teknologi baru yang menggabungkan mikroskop confocal pemindaian laser dan teknologi eksitasi dua foton.
Prinsip dasar eksitasi dua foton adalah: dalam kasus kerapatan foton tinggi, molekul fluoresen dapat menyerap dua foton dengan panjang gelombang panjang pada saat yang sama, dan memancarkan foton dengan panjang gelombang lebih pendek setelah periode singkat yang disebut masa hidup keadaan tereksitasi. . ; Efeknya sama dengan menggunakan foton dengan panjang gelombang setengah dari panjang gelombang untuk membangkitkan molekul fluoresen. Eksitasi dua foton membutuhkan kerapatan foton yang tinggi. Agar tidak merusak sel, mikroskop dua-foton menggunakan laser berdenyut mode-energi tinggi. Laser yang dipancarkan oleh laser ini memiliki energi puncak yang tinggi dan energi rata-rata yang rendah, lebar pulsanya hanya 100 femtosekon, dan periodenya dapat mencapai 80 hingga 100 megahertz. Saat menggunakan lensa objektif apertur numerik tinggi untuk memfokuskan foton laser berdenyut, kerapatan foton pada titik fokus lensa objektif adalah yang tertinggi, dan eksitasi dua foton hanya terjadi pada titik fokus lensa objektif, jadi mikroskop dua-foton tidak memerlukan lubang jarum confocal, yang meningkatkan efisiensi deteksi Fluoresensi. Ini adalah metode penelitian penting di bidang morfologi, biologi sel molekuler, ilmu saraf, dan farmakologi.
1. Latar belakang munculnya mikroskop dua foton - dua keterbatasan mikroskop confocal laser tradisional:
1) Salah satunya adalah fenomena fototoksisitas: karena lubang jarum confocal harus cukup kecil untuk mendapatkan gambar beresolusi tinggi, dan bukaan kecil akan menghalangi sebagian besar fluoresensi yang dipancarkan dari sampel, termasuk fluoresensi yang dipancarkan dari bidang fokus, yang sesuai Ya, lampu eksitasi harus cukup kuat untuk mendapatkan rasio signal-to-noise yang memadai; dan laser intensitas tinggi akan menyebabkan pewarna fluoresen memudar dengan cepat selama pemindaian terus menerus, dan sinyal fluoresen akan menjadi semakin lemah saat pemindaian berlangsung.
2) Fototoksisitas adalah masalah lain. Di bawah iradiasi laser, banyak molekul pewarna fluoresen akan menghasilkan sitotoksin seperti oksigen singlet atau radikal bebas, sehingga waktu pemindaian dan kerapatan daya optik cahaya eksitasi harus dibatasi dalam percobaan untuk mempertahankan kerapatan sampel. aktif. Dalam penelitian terhadap sampel aktif, khususnya pada berbagai tahap pertumbuhan dan perkembangan sampel aktif, photobleaching dan phototoxicity membuat penelitian tersebut sangat terbatas.
2. Mengapa Anda mengatakan bahwa mikroskop dua foton umumnya tidak perlu dilengkapi dengan laser eksitasi ultraviolet?
Mikroskopi dua foton adalah teknologi eksitasi fluoresensi berdasarkan efek eksitasi dua foton: molekul pewarna fluoresen dapat dieksitasi dengan menyerap dua foton berenergi rendah secara bersamaan (interval waktu antara dua foton yang mencapai molekul fluoresen kurang dari 1 femtodetik ), efek eksitasinya bisa setara dengan menyerap foton berenergi tinggi 1/2 panjang gelombang. Misalnya, menyerap dua foton pada panjang gelombang merah setara dengan molekul yang menyerap ultraviolet. Foton dengan panjang gelombang panjang tidak mudah diserap oleh sel, sehingga fototoksisitas terhadap sel hidup berkurang, dan photobleaching juga berkurang. Dengan cara ini, tidak hanya memainkan fungsi eksitasi ultraviolet, tetapi juga menghindari kerusakan sinar ultraviolet pada sampel.
3. Apa keistimewaan laser dari mikroskop dua foton?
Probabilitas penyerapan dua foton bergantung pada seberapa dekat dua foton datang bertepatan dalam ruang dan waktu (dua foton harus tiba dalam 10-18 detik). Penampang serapan dua foton kecil, dan hanya fluorofor di daerah dengan fluks foton besar yang tereksitasi. Oleh karena itu, sebagian besar laser yang digunakan adalah laser titanium safir, yang dapat mencapai kecepatan pemindaian picosecond atau femtosecond, dan memiliki daya puncak yang sangat tinggi dan daya rata-rata yang rendah, sehingga photobleaching dan phototoxicity dapat dikurangi atau dihilangkan. Yang paling penting adalah memberikan kerapatan foton yang sangat tinggi dalam rentang kecil, yang dapat memastikan eksitasi simultan dari dua foton.
4. Apa keuntungan eksitasi dua foton?
1) Tingkatkan selektivitas pewarna: rentang cahaya eksitasi laser sistem confocal (Ar, Ar/Kr, HeNe) adalah 488nm - 647nm. Ini berarti bereksperimen dengan pewarna fluoresen tereksitasi UV, misalnya dengan DAPI , Hoescht. Panjang gelombang eksitasi dua-foton adalah dua kali lipat dari foton tunggal, sehingga pewarna yang tereksitasi oleh ultraviolet dapat tereksitasi oleh cahaya inframerah-dekat.
2) Kurangi photobleaching: Karena pengurangan photobleaching, tingkat keberhasilan eksperimen menggunakan CFP/YFP untuk transfer energi resonansi fluoresensi (FRET) meningkat.
3) Tidak diperlukan lensa objektif khusus: Dari sudut pandang perangkat keras, eksitasi pewarna tereksitasi UV dengan panjang gelombang cahaya inframerah-dekat tidak memerlukan komponen optik UV khusus.
4) Tingkatkan rasio signal-to-noise: panjang gelombang cahaya eksitasi dan panjang gelombang cahaya yang dipancarkan memiliki perbedaan besar, yang meningkatkan rasio signal-to-noise.
5) Pemutihan terlokalisasi ke titik fokus: Karena eksitasi fluoresensi hanya terjadi pada titik fokus tujuan, tidak diperlukan lubang jarum confocal. Ini meningkatkan deteksi cahaya dan photobleaching hanya terjadi pada titik fokus.
6) Lebih mudah menembus spesimen: Cahaya panjang gelombang inframerah tidak mudah dihamburkan oleh sel dan dapat menembus spesimen yang lebih dalam.
5. Dibandingkan dengan mikroskop confocal pemindaian laser, apa peningkatan terbesar yang dibuat oleh mikroskop dua foton?
1) Mengurangi photobleaching.
2) Mengurangi fototoksisitas.
3) Tidak mudah menyebar, dan lebih mudah menembus sampel yang tebal, seperti irisan otak.
