Prinsip Mikroskopi Confocal
Mikroskop confocal adalah instrumen pencitraan presisi tinggi yang muncul dan dikembangkan pada 1980-an, dan merupakan instrumen penelitian ilmiah penting untuk mempelajari struktur submikron. Dengan perkembangan komputer, perangkat lunak pengolah gambar, dan laser, mikroskop confocal juga mengalami perkembangan besar, dan sekarang banyak digunakan di bidang biologi, sistem mikro, dan pengukuran material. Mikroskop konfokal adalah jenis baru mikroskop yang mengintegrasikan prinsip konfokal, teknologi pemindaian, dan teknologi pemrosesan grafis komputer. Keuntungan utamanya adalah: resolusi lateral yang tinggi dan resolusi aksial yang tinggi, dan penekanan cahaya yang menyimpang secara efektif, dengan kontras tinggi.
Pengaturan mikroskop confocal tipikal adalah menempatkan dua lubang kecil pada bidang konjugasi bidang fokus objek yang diukur, salah satunya ditempatkan di depan sumber cahaya dan yang lainnya ditempatkan di depan detektor, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1. Dapat dilihat dari gambar bahwa ketika sampel yang diukur berada pada bidang kuasi-fokus, intensitas cahaya yang dikumpulkan oleh ujung deteksi adalah yang terbesar; ketika sampel yang diukur berada di posisi tidak fokus, titik cahaya pada ujung deteksi berdifusi dan intensitas cahaya menurun dengan cepat. Oleh karena itu, hanya cahaya yang dipancarkan oleh titik-titik pada bidang fokus yang dapat melewati lubang jarum keluar, sedangkan cahaya yang dipancarkan oleh titik-titik di luar bidang fokus tidak fokus pada bidang lubang jarum keluar, dan sebagian besar tidak dapat melewati lubang jarum pusat. Oleh karena itu, titik target observasi pada bidang fokus tampak cerah, dan titik non-observasi tampak hitam sebagai latar belakang, meningkatkan kontras dan memperjelas gambar. Selama proses pencitraan, dua lubang kecil adalah confocal, titik confocal adalah titik yang terdeteksi, dan bidang tempat titik yang terdeteksi berada adalah bidang confocal.
Ukuran lubang jarum pada detektor dalam mikroskop confocal memainkan peran penting. Ini secara langsung mempengaruhi resolusi dan rasio signal-to-noise dari sistem. Jika lubang jarum terlalu besar, efek deteksi confocal tidak akan tercapai, yang tidak hanya mengurangi resolusi sistem, tetapi juga menghasilkan lebih banyak cahaya liar; jika lubang jarum terlalu kecil, ini akan mengurangi efisiensi pendeteksian dan mengurangi gambar mikroskopis. kecerahan. Penelitian telah menunjukkan bahwa ketika diameter lubang jarum sama dengan diameter piringan Airy, persyaratan confocal terpenuhi, dan efisiensi pendeteksian tidak berkurang secara signifikan. Karena diameter lubang jarum umumnya berukuran mikron, jika terdapat penyimpangan antara titik fokus sinar laser dan posisi lubang jarum, akan terjadi distorsi sinyal. Oleh karena itu, mikroskop confocal umumnya menggunakan sistem fokus otomatis, yang secara virtual meningkatkan waktu pengukuran.
Karena mikroskop pemindaian confocal laser adalah pencitraan titik, untuk mendapatkan gambar dua dimensi dari objek, perlu menggunakan pemindaian dua dimensi dalam arah x dan y. Mikroskop yang berbeda menggunakan metode pemindaian yang berbeda:
(1) Pemindaian objek. Artinya, benda itu sendiri bergerak menurut hukum tertentu, sedangkan berkas cahayanya tetap tidak berubah. Keuntungan: jalur optik stabil; Kekurangan: diperlukan meja pemindaian yang besar, sehingga kecepatan pemindaian sangat terbatas.
(2) Sistem pemindaian sinar dibentuk dengan menggunakan galvanometer reflektif. Artinya, dengan mengontrol galvanometer pemindaian, titik cahaya terfokus secara teratur dipantulkan ke lapisan tertentu dari objek untuk menyelesaikan pemindaian dua dimensi. Keuntungannya adalah memiliki presisi tinggi dan sering digunakan untuk pengukuran presisi tinggi. Kecepatan pemindaian telah meningkat dibandingkan pemindaian objek, tetapi masih belum cepat.
(3) Gunakan elemen defleksi akustik-optik untuk pemindaian, dan pemindaian diwujudkan dengan mengubah frekuensi keluaran gelombang suara dan kemudian mengubah arah transmisi gelombang cahaya. Keuntungannya yang luar biasa adalah kecepatan pemindaiannya sangat cepat. Sistem pemindaian yang dikembangkan oleh Amerika Serikat menggunakan deflektor akustik-optik untuk menghasilkan gambar video real-time. Hanya perlu 1/30 detik untuk memindai gambar dua dimensi, dan hampir mencapai keluaran waktu nyata.
(4) Pemindaian disk Nipkow. Proses pemindaian diselesaikan dengan memutar disk Nipkow sambil menjaga komponen lainnya tetap diam. Bisa dicitrakan sekaligus dan kecepatannya sangat cepat. Namun, karena berkas pencitraan adalah cahaya di luar sumbu, penyimpangan di luar sumbu lensa harus diperbaiki, dan tingkat pemanfaatan energi cahaya sangat rendah.
