Berapa Banyak yang Anda Ketahui Tentang Mikroskopi Fluoresensi
Mikroskop fluoresensi umumnya menggunakan lampu merkuri intensitas tinggi sebagai sumber cahaya eksitasi. Filter digunakan untuk menyaring cahaya yang tidak diinginkan, hanya menyisakan cahaya murni berintensitas tinggi yang menggairahkan fluorofor. Setelah cahaya monokromatik menyinari sampel melalui lensa objektif, sampel akan tereksitasi untuk memancarkan cahaya (fluoresensi), dan baik fluoresensi maupun cahaya eksitasi akan kembali sepanjang jalur optik lensa objektif. Dalam hal ini, cermin dichroic diperlukan untuk menyaring cahaya eksitasi. , membiarkan hanya fluoresensi yang perlu kita lihat.
Fluoresensi ini mencapai lensa mata di sepanjang jalur cahaya mikroskop, dan kemudian memasuki mata kita, di mana kita dapat melihat fluoresensi yang dipancarkan oleh fluorofor.
Pra-pemeriksaan dan penyesuaian mikroskop fluoresensi:
(1) Sebelum setiap pengamatan fluoresensi, perlu untuk secara rutin memeriksa penyelarasan filamen, fokus jalur optik, diafragma apertur, dan pengaturan diafragma lapangan dari perangkat fluoresensi.
(2) Apakah perakitan filter eksitasi / emisi fluoresensi yang diperlukan telah dipasang di konverter, apakah lensa objektif mikroskop fluoresensi dikonfigurasi dengan benar, dan menghilangkan noda minyak dan debu pada lensa depan lensa objektif.
(3) Jika pengamatan kontras fasa dari cahaya yang ditransmisikan dilakukan pada saat yang sama, perlu untuk memeriksa konjugasi pusat kondensor dan cincin kontras fasa yang berlawanan dengan lensa objektif.
(4) Periksa apakah pembawa sampel (kaca slide, kaca penutup, dan peralatan lainnya) tertutup cairan atau debu, dan apakah ketebalannya berada dalam rentang jarak kerja yang dikalibrasi dari lensa objektif. Sampel yang diiris tidak boleh terlalu tebal, sebaiknya kurang dari atau sama dengan 10 μm.
(5) Karena sumber penerangan mengandung sinar ultraviolet, pelat pelindung cahaya berwarna coklat ditempatkan di atas bagian depan panggung untuk mencegah sinar ultraviolet merusak retina.
(6) Ketidakstabilan tegangan akan mengurangi masa pakai lampu merkuri bertekanan tinggi, dan catu daya sumber cahaya dilengkapi dengan penstabil tegangan.
(7) Untuk memperpanjang umur lampu merkuri, dapat dimatikan 15 menit setelah dinyalakan; setelah daya fluoresen lampu merkuri dimatikan, perlu menunggu setidaknya 10 menit untuk menghidupkan kembali uap merkuri menjadi dingin dan kembali ke keadaan semula, jika tidak masa pakai lampu akan terpengaruh.
Pengamatan gambar dengan mikroskop fluoresensi:
(1) Sekitar 5-10 menit setelah menyalakan sumber cahaya neon, intensitas cahaya eksitasi cenderung stabil, dan sampel dimuat untuk observasi; untuk mencegah pemadaman fluoresensi sampel yang disebabkan oleh cahaya eksitasi berlebihan selama proses pemfokusan dan mencari objek, perkecil terlebih dahulu mikroskop fluoresensi Sesuaikan cahaya eksitasi ke intensitas sedang dengan diafragma apertur atau tambahkan filter ND, dan memindahkan tahap sampel secara teratur. Setelah mengonfirmasi gambar cermin, sesuaikan ke status fluoresen untuk pemotretan dan perekaman.
(2) Penyesuaian untuk kualitas gambar yang buruk. Selain faktor penyiapan sampel, penyesuaian yang perlu dilakukan adalah:
① Kecualikan perangkat pelindung cahaya atau pembatas cahaya di jalur optik pencitraan, seperti aksesori DIC, filter ND, dll.
②Menyesuaikan kembali fokus penerima dan ukuran diafragma bukaan mikroskop fluoresensi.
③ Dengan hati-hati sesuaikan cincin koreksi perbedaan cakupan lensa objektif mikroskop fluoresensi.
Poin Aplikasi Mikroskopi Fluoresensi
Mikroskop fluoresensi menggunakan pencitraan "fluoresensi aktinik". Jika panjang gelombang eksitasi yang dipilih berada di wilayah dekat-ultraviolet (320-400nm), yang tidak terlihat oleh mata telanjang, spektrum emisi fluoresensi juga lebih pendek dari panjang gelombang rata-rata sumber cahaya cermin cahaya biasa. memperbaiki. Foton berenergi tinggi bertabrakan dengan elektron, menyebabkan elektron bertransisi dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi. Elektron dalam keadaan tereksitasi sangat tidak stabil dan akan jatuh kembali ke keadaan dasar. Dalam proses ini, sebagian energi termal akan dikonsumsi dan foton baru akan dipancarkan. Foton baru memiliki energi yang lebih rendah daripada foton asli dan karena itu memiliki panjang gelombang yang lebih panjang. Karena panjang gelombang foton baru berbeda dari panjang gelombang foton cahaya yang datang, dua berkas cahaya dengan panjang gelombang berbeda dipisahkan oleh metode pemrosesan optik tertentu, sehingga kita hanya melihat foton baru yang dipancarkan (sinyal fluoresensi), yaitu, mikroskop fluoresensi melihat gambar fluoresensi.
