Penerapan dan penggunaan prinsip mikroskop fluoresensi
(1) Prinsip dan karakteristik struktur mikroskop fluoresensi: mikroskop fluoresensi menggunakan sumber cahaya titik dengan efisiensi cahaya tinggi untuk memancarkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (seperti sinar ultraviolet 3650 inci atau cahaya biru ungu 4200 inci) melalui sistem filter sebagai lampu eksitasi untuk merangsang spesimen. Setelah zat fluoresen di dalamnya memancarkan fluoresensi berbagai warna, diamati melalui perbesaran lensa objektif dan lensa okuler. Dengan cara ini, di bawah latar belakang kontras yang kuat, meskipun fluoresensinya sangat lemah, mudah dikenali dan memiliki sensitivitas tinggi. Hal ini terutama digunakan untuk penelitian struktur dan fungsi sel serta komposisi kimia. Struktur dasar mikroskop fluoresensi terdiri dari mikroskop optik biasa ditambah beberapa aksesori (seperti sumber cahaya fluoresen, filter eksitasi, pemisah berkas dua warna dan filter pemblokiran, dll.). Sumber cahaya fluoresen - umumnya menggunakan lampu merkuri bertekanan sangat tinggi (50-200W), yang dapat memancarkan cahaya dengan berbagai panjang gelombang, namun setiap zat fluoresen memiliki panjang gelombang eksitasi yang menghasilkan fluoresensi terkuat, sehingga filter eksitasi (Umumnya, ada filter eksitasi ultraviolet, ungu, biru dan hijau), yang hanya memungkinkan cahaya eksitasi dengan panjang gelombang tertentu melewati dan menyinari spesimen, sambil menyerap cahaya lainnya. Setelah setiap zat diiradiasi dengan cahaya eksitasi, ia memancarkan fluoresensi tampak dengan panjang gelombang lebih panjang dari panjang gelombang iradiasi dalam waktu yang sangat singkat. Fluoresensi bersifat spesifik dan umumnya lebih lemah dibandingkan cahaya eksitasi. Untuk mengamati fluoresensi tertentu, diperlukan filter pemblokiran (atau penekan) di belakang lensa objektif. Fungsinya ada dua: pertama menyerap dan menghalangi cahaya eksitasi masuk ke lensa mata, agar tidak mengganggu fluoresensi dan merusak mata; yang lainnya adalah memilih dan membiarkan fluoresensi tertentu melewatinya, menunjukkan warna fluoresen tertentu. Kedua filter harus digunakan bersamaan.
Ada dua jenis mikroskop fluoresensi berdasarkan jalur optiknya:
1. Mikroskop fluoresensi transmisi: Sumber cahaya eksitasi dilewatkan melalui bahan spesimen melalui lensa kondensor untuk merangsang fluoresensi. Kolektor medan gelap biasanya digunakan, dan kolektor biasa juga dapat digunakan untuk mengatur cermin sehingga cahaya eksitasi dialihkan dan dilewati ke spesimen. Ini adalah mikroskop fluoresen yang lebih tua. Keuntungannya adalah fluoresensinya kuat pada perbesaran rendah, tetapi kerugiannya adalah fluoresensinya berkurang seiring bertambahnya perbesaran. Oleh karena itu, lebih baik mengamati material spesimen yang lebih besar.
2. Mikroskop epi-fluoresensi adalah jenis mikroskop fluoresensi baru yang dikembangkan di zaman modern. Perbedaannya adalah cahaya eksitasi jatuh dari lensa objektif ke permukaan spesimen, yaitu lensa objektif yang sama digunakan sebagai kondensor iluminasi dan lensa objektif untuk mengumpulkan fluoresensi. Pemisah berkas dichroic perlu ditambahkan pada jalur cahaya, yang berjarak 45 derajat dari uranium ringan. Cahaya eksitasi dipantulkan ke lensa objektif dan dikumpulkan pada sampel. Fluoresensi yang dihasilkan oleh sampel dan cahaya eksitasi yang dipantulkan oleh permukaan lensa lensa objektif dan permukaan kaca penutup memasuki lensa objektif pada saat yang bersamaan, dan kembali ke pemisah berkas dua warna untuk membuat cahaya eksitasi Terpisah dari fluoresensi , sisa cahaya eksitasi diserap oleh filter pemblokiran. Seperti mengganti kombinasi filter eksitasi yang berbeda/pemisah sinar dua warna/filter pemblokiran, ini dapat memenuhi kebutuhan produk reaksi fluoresen yang berbeda. Keuntungan dari mikroskop fluoresensi jenis ini adalah penerangan bidang pandangnya seragam, gambarannya jelas, dan semakin besar perbesarannya, semakin kuat fluoresensinya.
(2) Cara menggunakan mikroskop fluoresensi.
1. Nyalakan sumber cahaya, dan lampu merkuri bertekanan sangat tinggi perlu dipanaskan selama beberapa menit untuk mencapai titik paling terang.
2. Mikroskop fluoresensi transmisi perlu memasang filter eksitasi yang diperlukan antara sumber cahaya dan kondensor, dan memasang filter pemblokiran yang sesuai di belakang lensa objektif. Mikroskop epi-fluoresensi perlu memasukkan filter eksitasi/pemisah berkas dua warna/filter pemblokiran yang diperlukan ke dalam slot di jalur cahaya.
3. Amati dengan lensa perbesaran rendah, dan sesuaikan pusat sumber cahaya sehingga terletak di tengah seluruh titik iluminasi sesuai dengan perangkat penyesuaian berbagai model mikroskop fluoresensi.
4. Tempatkan potongan spesimen dan amati setelah pemfokusan. Perhatian harus diberikan saat penggunaan: jangan mengamati langsung dengan filter ujung, agar tidak menyebabkan kerusakan mata; saat mengamati spesimen dengan lensa minyak, lensa minyak khusus tanpa fluoresensi harus digunakan; setelah lampu merkuri bertekanan tinggi dimatikan tidak bisa langsung dinyalakan kembali, perlu dilakukan pengujian. Ini dapat dimulai kembali setelah 5 menit, jika tidak maka akan menjadi tidak stabil dan mempengaruhi umur lampu merkuri.
(3) Amati sel yang diwarnai dengan pewarna fluoresen oranye acridine 0,01% di bawah mikroskop fluoresen pada platform pengajaran dengan filter cahaya biru-ungu. Inti dan sitoplasma tereksitasi menghasilkan dua warna fluoresensi yang berbeda (hijau tua dan oranye-merah).
