Fitur dan Perbandingan Mikroskop Fluoresensi dan Mikroskop Optik Konvensional
Mikroskop fluoresensi berbeda dari mikroskop optik biasa. Alih-alih menerangi spesimen dengan sumber cahaya biasa, ia menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (biasanya sinar ultraviolet atau biru-ungu) untuk merangsang zat fluoresen di dalam spesimen untuk memancarkan fluoresensi. Cahaya dari sumber cahaya tidak digunakan untuk penerangan langsung, tetapi berfungsi sebagai energi eksitasi untuk zat fluoresen dalam spesimen. Oleh karena itu, kita dapat mengamati spesimen bukan karena iluminasi dari sumber cahaya, tetapi karena fluoresensi yang dipancarkan setelah zat fluoresen dalam spesimen menyerap cahaya eksitasi. Oleh karena itu, ciri utama mikroskop fluoresensi adalah bahwa sumber cahayanya harus memberikan cahaya eksitasi dengan panjang gelombang tertentu, yang memungkinkan zat fluoresen dalam spesimen memancarkan fluoresensi dengan intensitas yang cukup. Sementara itu, mikroskop fluoresensi harus dilengkapi dengan sistem filter khusus. Mikroskop fluoresensi merupakan instrumen mendasar untuk histokimia imunofluoresensi. Ini terutama terdiri dari sumber cahaya bertekanan sangat tinggi, set filter (termasuk filter eksitasi dan penghalang), sistem optik dan komponen pendukung. Ia menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu untuk merangsang fluorofor.
Ada dua mode eksitasi yang diklasifikasikan berdasarkan rentang panjang gelombang: metode eksitasi UV (metode iradiasi ultraviolet) dan metode eksitasi BV (metode eksitasi biru-ungu).
Metode eksitasi UV: Sinar ultraviolet dekat yang lebih pendek dari 400 nm digunakan untuk eksitasi. Tidak ada cahaya eksitasi yang terlihat dalam metode ini. Fluoresensi yang diamati menunjukkan fluoresensi intrinsik pewarna, sehingga memudahkan untuk membedakan fluoresensi spesifik pada spesimen dari autofluoresensi jaringan latar belakang.
Metode eksitasi BV: Eksitasi dilakukan dengan cahaya yang berpusat pada 404 nm dan 434 nm, mulai dari ultraviolet hingga biru-ungu. Cahaya biru menyinari spesimen dalam metode ini. Oleh karena itu, filter penghalang sistem observasi fluoresensi harus sepenuhnya memblokir cahaya biru saat mentransmisikan fluoresensi hijau dan kuning yang diperlukan. Ini digunakan untuk fluorokrom dalam tes imunofluoresensi. Karena panjang gelombang serapan maksimum fluorokrom mendekati panjang gelombang eksitasi metode BV, cahaya biru dapat digunakan sebagai cahaya eksitasi, menghasilkan efisiensi penyerapan cahaya fluorokrom yang tinggi dan gambar yang relatif jernih. Kerugiannya adalah fluoresensi pada panjang gelombang di bawah 500 nm tidak dapat diamati, dan hanya sinyal fluoresensi di atas 500 nm yang dapat ditampilkan pada gambar. Dalam uji imunofluoresensi, fluorokrom diidentifikasi sebagian berdasarkan warnanya. Oleh karena itu, ketika kekhususan halus dibahas, kelemahan metode eksitasi BV di atas memiliki dampak yang signifikan.
