Perbedaan Mikroskop Fluoresensi dan Mikroskop Cahaya Biasa
Mikroskop fluoresensi berbeda dari mikroskop optik konvensional. Daripada mengamati spesimen dengan cahaya dari sumber cahaya biasa, mereka menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (biasanya sinar ultraviolet atau sinar biru-ungu) untuk merangsang zat fluoresen dalam spesimen pada slide mikroskop, menyebabkan zat tersebut memancarkan fluoresensi. Oleh karena itu, sumber cahaya mikroskop fluoresensi tidak menerangi spesimen secara langsung; ia bertindak sebagai sumber energi untuk merangsang zat fluoresen endogen dalam spesimen. Kita dapat melihat spesimen bukan karena iluminasi dari sumber cahaya itu sendiri, tetapi karena zat fluoresen di dalam spesimen menyerap energi cahaya eksitasi dan kemudian memancarkan fluoresensi.
Oleh karena itu, ciri utama mikroskop fluoresensi adalah bahwa sumber cahayanya dapat menyuplai cahaya eksitasi dengan pita panjang gelombang tertentu, memungkinkan zat fluoresen dalam spesimen yang diperiksa memancarkan fluoresensi dengan intensitas yang cukup. Sedangkan mikroskop fluoresensi harus dilengkapi dengan sistem filter yang sesuai. Ini adalah instrumen penting untuk histokimia fluoresensi. Mikroskop fluoresensi terutama terdiri dari sumber cahaya bertekanan sangat tinggi, sistem filter (termasuk filter eksitasi dan filter penghalang), sistem optik, dan sistem fotografi. Ia bekerja dengan menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu untuk merangsang zat fluoresen.
① Metode Eksitasi FluoresensiMenurut rentang panjang gelombang cahaya eksitasi, ada dua jenis: metode eksitasi UV (metode iluminasi ultraviolet) dan metode eksitasi BV (metode iluminasi biru-ungu). Metode eksitasi UV menggunakan sinar ultraviolet yang lebih pendek dari 400 nm untuk eksitasi. Ini menghasilkan fluoresensi yang tidak terlihat, sehingga fluoresensi yang diamati berasal dari spesimen itu sendiri. Metode ini dengan mudah membedakan fluoresensi spesifik dari autofluoresensi latar belakang.
② Metode Eksitasi BV Metode eksitasi BV menggunakan cahaya eksitasi mulai dari ungu hingga biru yang berpusat pada 404 nm dan 434 nm. Karena cahaya biru digunakan untuk menyinari spesimen, sistem filter eksitasi untuk metode ini harus sepenuhnya memblokir cahaya biru dan hanya membiarkan cahaya hijau dan kuning yang diperlukan melewatinya. Untuk pewarnaan antibodi fluoresen, panjang gelombang serapan maksimum dari cahaya eksitasi mendekati panjang gelombang emisi maksimum pewarna fluoresen. Oleh karena itu, rangkaian filter untuk eksitasi BV harus menggunakan filter penghalang potong. Metode ini menggunakan cahaya biru untuk eksitasi, sehingga efisiensi pengumpulan fluoresensi relatif tinggi dan gambar yang lebih terang dapat diperoleh. Kerugiannya adalah fluoresensi di atas 500 nm tidak dapat dideteksi, dan hanya gambar kuning-hijau yang dapat dilihat di atas 500 nm. Dalam pewarnaan antibodi fluoresen, penilaian spesifisitas sangat bergantung pada informasi warna, sehingga kelemahan metode eksitasi BV dapat menjadi batasan utama ketika membahas spesifisitas yang tidak kentara.
