Perbedaan Antara Mikroskop Fluoresensi dan Mikroskop Normal
1. Perhatikan metode pencahayaan
Metode pencahayaan mikroskop fluoresensi umumnya tipe epi, artinya, sumber cahaya ditempatkan pada sampel uji melalui lensa objektif.
2. Lihat resolusinya
Mikroskop fluoresensi menggunakan sinar ultraviolet sebagai sumber cahaya, dengan panjang gelombang yang relatif pendek, tetapi resolusinya lebih tinggi daripada mikroskop optik biasa.
3, perbedaan dalam filter
Mikroskop fluoresensi menggunakan dua filter khusus, digunakan di depan sumber cahaya untuk menyaring cahaya tampak, dan digunakan antara lensa objektif dan lensa mata untuk menyaring sinar ultraviolet, yang dapat melindungi mata manusia.
Mikroskop fluoresensi juga merupakan jenis mikroskop optik, terutama karena panjang gelombang yang dieksitasi oleh mikroskop fluoresensi pendek, sehingga hal ini menyebabkan perbedaan struktur dan penggunaan mikroskop fluoresensi dan mikroskop biasa. Sebagian besar mikroskop fluoresensi memiliki fungsi yang baik dalam menangkap cahaya lemah. , jadi di bawah fluoresensi yang sangat lemah, kemampuan pencitraannya juga bagus. Ditambah dengan peningkatan berkelanjutan mikroskop fluoresensi dalam beberapa tahun terakhir, kebisingan juga telah sangat berkurang. Oleh karena itu, semakin banyak mikroskop fluoresensi yang digunakan.
Pengetahuan tentang Mikroskopi Fluoresensi Dua-Foton
Prinsip dasar eksitasi dua foton adalah: dalam kasus kerapatan foton tinggi, molekul fluoresen dapat menyerap dua foton dengan panjang gelombang panjang pada saat yang sama, dan setelah masa hidup keadaan tereksitasi yang sangat singkat, memancarkan foton dengan panjang gelombang pendek ; efeknya sama dengan menggunakan foton dengan panjang gelombang setengah dari panjang gelombang panjang untuk membangkitkan molekul fluoresen. Eksitasi dua foton membutuhkan kerapatan foton yang tinggi, dan agar tidak merusak sel, mikroskop dua foton menggunakan laser berdenyut mode-terkunci berenergi tinggi. Laser ini memancarkan sinar laser dengan energi puncak tinggi dan energi rata-rata rendah, dengan lebar pulsa hanya 100 femtosekon dan frekuensi 80 hingga 100 MHz. Ketika lensa objektif apertur numerik tinggi digunakan untuk memfokuskan foton laser berdenyut, kerapatan foton pada titik fokus lensa objektif adalah yang tertinggi, dan eksitasi dua foton hanya terjadi pada titik fokus lensa objektif, sehingga mikroskop dua-foton tidak memerlukan lubang jarum confocal, yang meningkatkan efisiensi pendeteksian Fluoresensi.
Dalam fenomena fluoresensi umum, karena kerapatan foton cahaya eksitasi yang rendah, molekul fluoresen hanya dapat menyerap satu foton pada saat yang sama, dan kemudian memancarkan foton fluoresen melalui transisi radiasi, yang disebut fluoresensi foton tunggal. Untuk proses eksitasi fluoresensi dengan laser sebagai sumber cahaya, fenomena fluoresensi dua-foton atau bahkan multi-foton dapat terjadi. Saat ini, intensitas sumber cahaya eksitasi yang digunakan tinggi, dan kerapatan foton memenuhi persyaratan bahwa molekul fluoresen menyerap dua foton pada saat yang bersamaan. Dalam proses penggunaan laser umum sebagai sumber cahaya eksitasi, kerapatan foton masih belum cukup untuk menghasilkan penyerapan dua foton. Biasanya, laser berdenyut femtosecond digunakan, dan daya seketikanya dapat mencapai urutan megawatt. Oleh karena itu, panjang gelombang fluoresensi dua foton lebih pendek dari panjang gelombang cahaya eksitasi, yang setara dengan efek yang dihasilkan oleh eksitasi panjang gelombang setengah eksitasi.
Mikroskop fluoresensi dua foton memiliki banyak keuntungan:
1) Cahaya dengan panjang gelombang panjang kurang terpengaruh oleh hamburan dibandingkan dengan cahaya dengan panjang gelombang pendek dan dapat dengan mudah menembus spesimen;
2) Molekul fluoresen di luar bidang fokus tidak tereksitasi, sehingga lebih banyak cahaya eksitasi dapat mencapai bidang fokus, sehingga cahaya eksitasi dapat menembus spesimen yang lebih dalam;
3) Cahaya inframerah-dekat dengan panjang gelombang panjang kurang beracun bagi sel daripada cahaya dengan panjang gelombang pendek;
4) Saat melihat spesimen dengan mikroskop dua foton, photobleaching dan phototoxicity hanya ada pada bidang fokus. Oleh karena itu, mikroskop dua foton lebih cocok untuk melihat spesimen tebal daripada mikroskop foton tunggal, untuk melihat sel hidup, atau untuk melakukan percobaan pemutihan foto titik tetap.
Pengetahuan tentang mikroskop fluoresensi confocal
Prinsip dasar mikroskop fluoresensi confocal: menggunakan sumber cahaya titik untuk menerangi spesimen, titik cahaya kecil dengan garis besar yang jelas terbentuk pada bidang fokus. terdiri dari beam splitter. Pembagi sinar mengirimkan fluoresensi langsung ke detektor. Ada lubang jarum di depan sumber cahaya dan detektor, masing-masing disebut lubang jarum iluminasi dan lubang jarum pendeteksi. Dimensi geometris keduanya sama, sekitar 100-200 nm; relatif terhadap titik cahaya pada bidang fokus, keduanya berkonjugasi, yaitu titik cahaya melewati serangkaian lensa, dan akhirnya dapat difokuskan pada lubang jarum iluminasi dan lubang jarum deteksi pada saat yang bersamaan. Dengan cara ini, cahaya dari bidang fokus dapat dikonsentrasikan dalam jangkauan lubang deteksi, sedangkan cahaya yang tersebar dari atas atau bawah bidang fokus diblokir dari lubang deteksi dan tidak dapat dicitrakan. Sampel dipindai titik demi titik dengan laser, dan tabung pengganda foto setelah mendeteksi lubang jarum juga memperoleh gambar confocal dari titik titik cahaya yang sesuai, yang diubah menjadi sinyal digital dan ditransmisikan ke komputer, dan akhirnya dikumpulkan pada layar menjadi gambar confocal yang jelas dari seluruh bidang fokus. .
Setiap gambar bidang fokus sebenarnya merupakan penampang optik dari spesimen, dan penampang optik ini selalu memiliki ketebalan tertentu, juga dikenal sebagai irisan optik. Karena intensitas cahaya pada titik fokus jauh lebih besar daripada pada titik non-fokus, dan cahaya bidang non-fokus disaring oleh lubang jarum, kedalaman bidang sistem confocal kira-kira nol, dan pemindaian sepanjang Sumbu Z dapat mewujudkan tomografi optik, membentuk Amati bagian optik dua dimensi di titik fokus sampel. Menggabungkan pemindaian bidang XY (bidang fokus) dengan pemindaian sumbu Z (sumbu optik), dengan mengumpulkan gambar dua dimensi dari lapisan yang berurutan dan memproses dengan perangkat lunak komputer khusus, gambar sampel tiga dimensi dapat diperoleh.
Artinya, lubang jarum deteksi dan lubang jarum sumber cahaya selalu terfokus pada titik yang sama, sehingga fluoresensi yang tereksitasi di luar bidang fokus tidak dapat masuk ke lubang jarum deteksi.
Ekspresi sederhana dari prinsip kerja laser confocal adalah bahwa ia menggunakan laser sebagai sumber cahaya, dan berdasarkan pencitraan mikroskop fluoresensi tradisional, perangkat pemindaian laser dan perangkat pemfokusan konjugasi terpasang, dan akuisisi dan pemrosesan gambar digital sistem dikendalikan oleh komputer.
