Perbedaan antara mikroskop fluoresensi dan mikroskop normal
Saya baru-baru ini mencoba membuat beberapa bagian tikus yang dibekukan. Selanjutnya saya akan menggunakan mikroskop fluoresensi untuk melihat apakah virus yang saya suntikkan ada di area otak yang saya inginkan. Beberapa prinsip dasar mikroskop fluoresensi perlu dipelajari secara singkat, dan akan saya bagikan di sini.
Mikroskop fluoresensi menggunakan sinar ultraviolet sebagai sumber cahaya untuk menerangi objek yang diperiksa sehingga menyebabkan objek tersebut memancarkan cahaya, dan kemudian mengamati objek tersebut di bawah mikroskop. Ini terutama digunakan untuk sel imunofluoresensi. Hal ini terutama terdiri dari sumber cahaya, sistem pelat filter dan sistem optik. Gambar fluoresen sampel diamati melalui perbesaran lensa okuler dan lensa objektif. Mari kita lihat perbedaan antara mikroskop fluoresensi dan mikroskop optik biasa.
1. Perhatikan metode pencahayaan
Metode iluminasi mikroskop fluoresensi umumnya adalah epi-iluminasi, artinya sumber cahaya ditempatkan pada sampel uji melalui lensa objektif.
2. Lihatlah resolusinya
Mikroskop fluoresensi menggunakan sinar ultraviolet sebagai sumber cahaya, yang memiliki panjang gelombang lebih pendek tetapi resolusi lebih tinggi dibandingkan mikroskop optik biasa.
3. Perbedaan filter
Mikroskop fluoresensi menggunakan dua filter khusus, satu digunakan di depan sumber cahaya untuk menyaring cahaya tampak, dan satu lagi digunakan di antara lensa objektif dan lensa mata untuk menyaring sinar ultraviolet, yang dapat melindungi mata manusia.
Mikroskop fluoresensi juga merupakan jenis mikroskop optik. Alasan utamanya adalah panjang gelombang yang dieksitasi oleh mikroskop fluoresensi pendek, sehingga menyebabkan perbedaan struktur dan penggunaan antara mikroskop fluoresensi dan mikroskop biasa. Kebanyakan mikroskop fluoresensi memiliki fungsi yang baik dalam menangkap cahaya lemah. , jadi kemampuan pencitraannya juga bagus dalam fluoresensi yang sangat lemah. Ditambah dengan perbaikan terus-menerus pada mikroskop fluoresensi dalam beberapa tahun terakhir, kebisingan juga telah sangat berkurang. Oleh karena itu, semakin banyak mikroskop fluoresensi yang digunakan.
Pengetahuan tentang mikroskop fluoresensi dua foton
Prinsip dasar eksitasi dua foton adalah: dalam kondisi kepadatan foton yang tinggi, molekul fluoresen dapat menyerap dua foton dengan panjang gelombang panjang pada saat yang sama, dan setelah masa hidup yang disebut keadaan tereksitasi yang singkat, ia memancarkan foton dengan panjang gelombang yang lebih pendek. . ;Efeknya sama dengan menggunakan foton dengan panjang gelombang setengah panjang gelombang untuk merangsang molekul fluoresen. Eksitasi dua foton memerlukan kepadatan foton yang tinggi. Agar tidak merusak sel, mikroskop dua foton menggunakan laser pulsa terkunci mode energi tinggi. Laser ini memancarkan sinar laser dengan energi puncak tinggi dan energi rata-rata rendah, dengan lebar pulsa hanya 100 femtodetik dan frekuensi 80 hingga 100 MHz. Saat menggunakan lensa objektif bukaan numerik tinggi untuk memfokuskan foton laser berdenyut, kerapatan foton pada fokus lensa objektif adalah yang tertinggi. Eksitasi dua foton hanya terjadi pada fokus lensa objektif, sehingga mikroskop dua foton tidak memerlukan lubang jarum confocal, sehingga meningkatkan efisiensi deteksi Fluoresensi.
Dalam fenomena fluoresensi umum, karena rendahnya kerapatan foton dari cahaya eksitasi, molekul fluoresen hanya dapat menyerap satu foton pada saat yang sama dan kemudian memancarkan satu foton fluoresensi melalui transisi radiasi. Ini adalah fluoresensi foton tunggal. Untuk proses eksitasi fluoresensi yang menggunakan laser sebagai sumber cahaya, fenomena fluoresensi dua foton atau bahkan multi-foton dapat terjadi. Dalam hal ini, intensitas sumber cahaya eksitasi yang digunakan tinggi, dan kerapatan foton memenuhi persyaratan molekul fluoresen untuk menyerap dua foton pada saat yang bersamaan. Dalam proses penggunaan laser biasa sebagai sumber cahaya eksitasi, kerapatan foton masih belum cukup untuk menghasilkan serapan dua foton. Laser pulsa femtosecond biasanya digunakan, dan daya sesaatnya dapat mencapai tingkat megawatt. Oleh karena itu, panjang gelombang fluoresensi dua foton lebih pendek dari panjang gelombang cahaya eksitasi, yang setara dengan efek yang dihasilkan oleh eksitasi panjang gelombang setengah eksitasi.
