Perbandingan antara mikroskop confocal dan mikroskop optik biasa
Mikroskop optik umum
Mikroskop biologi umum terdiri dari tiga bagian, yaitu: ① sistem penerangan, termasuk sumber cahaya dan kondensor; ② Sistem amplifikasi optik, yang terdiri dari lensa objektif dan lensa okuler, merupakan bagian utama mikroskop. Untuk menghilangkan aberasi bola dan aberasi kromatik, lensa okuler dan lensa objektif terdiri dari kelompok lensa kompleks; (3) perangkat mekanis, digunakan untuk memperbaiki bahan dan memudahkan observasi.
Jelas atau tidaknya gambar mikroskop tidak hanya bergantung pada perbesarannya, tetapi juga pada resolusi mikroskop. Resolusi mengacu pada kemampuan mikroskop (atau tempat mata manusia berjarak 25cm dari sasaran) untuk membedakan interval kecil suatu benda zui. Resolusinya bergantung pada panjang gelombang cahaya, rasio bukaan dan indeks bias medium, yang dinyatakan dengan rumus:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎdosa /2
Dimana: n= indeks bias medium;=sudut cermin (sudut bukaan spesimen terhadap bukaan lensa), dan bukaan numerik NA=. Sudut cermin selalu kurang dari 180? Oleh karena itu, nilai zui sina/2 harus kurang dari 1.
Indeks bias kaca yang digunakan untuk membuat lensa optik adalah 1,65~1,78, dan indeks bias media yang digunakan semakin mendekati indeks bias kaca, semakin baik. Untuk lensa objektif kering, medianya adalah udara, dan rasio bukaan umumnya 0.05 ~ 0,95; Lensa oli menggunakan aspal wangi sebagai medianya, dan kecepatan pembukaan lensa bisa mendekati 1,5.
Panjang gelombang cahaya biasa adalah 400~700nm, sehingga resolusi mikroskop tidak kurang dari 0,2μm, dan resolusi mata manusia adalah 0,2mm, sehingga perbesaran besar zui dirancang oleh mikroskop umum biasanya 1000X x.
Mengapa Anda membutuhkan mikroskop confocal?
1. Mikroskop optik telah disempurnakan melalui upaya dan peningkatan pendahulu kita yang hebat. Faktanya, mikroskop biasa dapat memberikan kita gambar mikroskopis yang indah dengan sederhana dan cepat. Namun terjadilah peristiwa yang membawa inovasi revolusioner ke dunia mikroskop yang hampir sempurna ini, yaitu penemuan "mikroskop confocal pemindaian laser". Mikroskop baru ini dicirikan dengan mengadopsi sistem optik yang hanya mengekstrak informasi gambar pada bidang di mana fokus terkonsentrasi, dan memulihkan informasi yang diperoleh dalam memori gambar sambil mengubah fokus, sehingga gambar menjadi jelas dengan informasi tiga dimensi yang lengkap. Bisa didapatkan. Dengan metode ini, informasi tentang bentuk permukaan yang tidak dapat dipastikan dengan mikroskop biasa dapat diperoleh dengan mudah. Selain itu, untuk mikroskop optik biasa, "meningkatkan resolusi" dan "memperdalam kedalaman fokus" adalah kondisi yang kontradiktif, terutama pada perbesaran tinggi, tetapi untuk mikroskop confocal, masalah ini telah terpecahkan.
2. Keuntungan sistem optik confocal
Sistem optik confocal menerangi titik sampel, dan cahaya yang dipantulkan juga diterima oleh reseptor titik. Ketika sampel ditempatkan pada posisi fokus, hampir seluruh cahaya yang dipantulkan dapat mencapai fotoreseptor, namun ketika sampel menyimpang dari fokus, cahaya yang dipantulkan tidak dapat mencapai fotoreseptor. Artinya, dalam sistem optik confocal, hanya gambar yang bertepatan dengan fokus yang akan dihasilkan, dan facula serta cahaya tersebar yang tidak berguna akan terlindung.
3. Mengapa menggunakan laser?
Dalam sistem optik confocal, sampel disinari dan cahaya yang dipantulkan juga diterima oleh fotoreseptor titik. Oleh karena itu, sumber cahaya titik menjadi diperlukan. Laser termasuk dalam sumber cahaya yang sangat titik. Dalam kebanyakan kasus, sumber cahaya mikroskop confocal mengadopsi sumber cahaya laser. Selain itu, karakteristik laser, seperti monokromatisitas, directivity, dan bentuk sinar yang sangat baik, juga merupakan alasan penting untuk penggunaannya secara luas.
4. Observasi real-time berdasarkan pemindaian berkecepatan tinggi menjadi mungkin.
Dalam pemindaian laser, Deflektor Optik Akustik (elemen utama AO) digunakan dalam arah horizontal dan cermin Servo Galvano digunakan dalam arah vertikal. Karena tidak ada bagian getaran mekanis pada unit defleksi optik akustik, unit ini dapat memindai dengan kecepatan tinggi, dan dapat diamati secara real time di layar pemantauan. Kecepatan tinggi kamera ini merupakan proyek yang sangat penting yang secara langsung mempengaruhi kecepatan pemfokusan dan pengambilan posisi.
5. Hubungan antara posisi fokus dan kecerahan
Dalam sistem optik confocal, ketika sampel ditempatkan dengan benar pada posisi fokus, kecerahannya besar, dan sebelum dan sesudahnya, kecerahannya akan turun tajam (garis padat pada Gambar 4). Selektivitas sensitif bidang fokus ini juga merupakan prinsip pengukuran arah ketinggian mikroskop confocal dan memperluas kedalaman fokus. Sebaliknya, mikroskop optik biasa tidak mengalami perubahan kecerahan yang jelas sebelum dan sesudah posisi fokus (garis putus-putus pada Gambar 4).
6. Kontras tinggi dan resolusi tinggi
Pada mikroskop optik umum, pantulan cahaya yang menyimpang dari fokus akan mengganggu, dan akan tumpang tindih dengan bagian pencitraan fokus, sehingga mengurangi kontras gambar. Sebaliknya, pada sistem optik confocal, cahaya yang tersebar di luar fokus dan cahaya yang tersebar di dalam lensa objektif hampir dihilangkan seluruhnya, sehingga dapat diperoleh gambar dengan kontras yang sangat tinggi. Selain itu, karena cahaya melewati lensa objektif dua kali, gambar titik dipertajam terlebih dahulu, dan resolusi mikroskop juga ditingkatkan.
7. Fungsi lokalisasi optik
Dalam sistem optik confocal, cahaya yang dipantulkan dari bagian selain titik fokus dilindungi oleh mikropori. Oleh karena itu, ketika mengamati sampel tiga dimensi, terbentuklah bayangan seperti yang terbentuk setelah sampel diiris dengan fokus (Gambar 5). Efek ini disebut lokalisasi optik, yang merupakan salah satu spesialisasi sistem optik confocal.
8. Fokus fungsi memori bergerak
Cahaya yang dipantulkan di luar fokus dilindungi oleh pori-pori mikro. Di sisi lain, dapat diasumsikan bahwa semua titik pada gambar yang dibentuk oleh sistem optik confocal bertepatan dengan fokus. Oleh karena itu, jika sampel tiga dimensi dipindahkan sepanjang arah sumbu Z (sumbu optik), gambar akan terakumulasi dan disimpan dalam memori, dan zui pada akhirnya akan mendapatkan gambar yang dibentuk oleh kebetulan seluruh sampel dan fokus. . Dengan cara ini, fungsi kedalaman fokus tak terbatas disebut fungsi memori seluler.
9. Fungsi pengukuran bentuk permukaan
Dalam fungsi perpindahan fokus, bentuk permukaan sampel dapat diukur dengan cara non-kontak dengan menambahkan loop perekam ketinggian. Berdasarkan fungsi tersebut, dimungkinkan untuk mencatat koordinat sumbu Z yang dibentuk oleh besarnya nilai kecerahan zui pada setiap piksel, dan berdasarkan informasi tersebut dapat diperoleh informasi terkait bentuk permukaan sampel.
10. Fungsi pengukuran ukuran mikro presisi tinggi
Unit penerima cahaya mengadopsi sensor pencitraan CCD satu dimensi, sehingga tidak terpengaruh oleh kemiringan pemindaian perangkat pemindai, sehingga pengukuran presisi tinggi dapat diselesaikan. Selain itu, karena fungsi memori perpindahan fokus dengan kedalaman fokus yang dapat disesuaikan diadopsi pada saat yang sama, kesalahan pengukuran yang disebabkan oleh offset fokus dapat dihilangkan.
11. Analisis gambar tiga dimensi
Dengan menggunakan fungsi pengukuran bentuk permukaan, gambar tiga dimensi permukaan sampel dapat dibuat dengan mudah. Tidak hanya itu, berbagai macam analisis juga dapat dilakukan, seperti: pengukuran kekasaran permukaan, luas, volume, luas permukaan, sirkularitas, jari-jari, panjang zui, keliling, pusat gravitasi, citra tomografi, transformasi FFT, garis pengukuran lebar dan sebagainya.
Mikroskop pemindaian confocal laser dapat digunakan tidak hanya untuk mengamati morfologi sel, tetapi juga untuk analisis kuantitatif komponen biokimia dalam sel, statistik kepadatan optik, dan pengukuran morfologi sel.
