Memahami mikroskop fluoresensi confocal
Prinsip dasar mikroskop fluoresensi confocal: Gunakan sumber cahaya titik untuk menerangi spesimen untuk membentuk titik cahaya kecil yang jelas pada bidang fokus. Fluoresensi yang dipancarkan titik setelah disinari dikumpulkan oleh lensa objektif dan dikembalikan ke cermin dikroik di sepanjang jalur cahaya iluminasi aslinya. merupakan pemecah sinar. Spektrometer mengirimkan fluoresensi langsung ke detektor. Terdapat lubang jarum di depan sumber cahaya dan detektor, yang masing-masing disebut lubang jarum penerangan dan lubang jarum pendeteksi. Dimensi geometris keduanya konsisten, sekitar 100-200nm; relatif terhadap titik cahaya pada bidang fokus, keduanya terkonjugasi, yaitu titik cahaya melewati serangkaian lensa dan pada akhirnya dapat difokuskan pada lubang jarum iluminasi dan lubang jarum pendeteksi pada saat yang bersamaan. Dengan cara ini, cahaya dari bidang fokus dapat terkonsentrasi dalam jangkauan lubang deteksi, sedangkan cahaya yang tersebar dari atas atau bawah bidang fokus diblokir di luar lubang deteksi dan tidak dapat dicitrakan. Sampel dipindai titik demi titik dengan laser, dan tabung pengganda foto di belakang lubang jarum pendeteksi juga memperoleh gambar confocal dari titik cahaya yang sesuai, yang diubah menjadi sinyal digital dan dikirimkan ke komputer, dan akhirnya dikumpulkan pada layar menjadi gambar confocal yang jelas dari seluruh bidang fokus. .
Setiap gambar bidang fokus sebenarnya merupakan penampang optik dari spesimen. Penampang optik ini selalu mempunyai ketebalan tertentu dan disebut juga dengan penampang tipis optik. Karena intensitas cahaya pada fokus jauh lebih besar daripada intensitas cahaya pada non-fokus, dan cahaya bidang non-fokus disaring oleh lubang jarum, kedalaman bidang sistem confocal kira-kira nol. Pemindaian sepanjang arah sumbu Z dapat mewujudkan tomografi optik, membentuk bagian optik dua dimensi yang diinginkan di titik fokus sampel. Dengan menggabungkan pemindaian bidang XY (bidang fokus) dengan pemindaian sumbu Z (sumbu optik), dengan mengumpulkan tingkat gambar dua dimensi secara terus menerus dan memprosesnya dengan perangkat lunak komputer khusus, gambar sampel tiga dimensi dapat diperoleh.
Artinya, lubang jarum pendeteksi dan lubang jarum sumber cahaya selalu terfokus pada titik yang sama, sehingga fluoresensi yang tereksitasi di luar bidang fokus tidak dapat masuk ke lubang jarum pendeteksi.
Ekspresi sederhana dari prinsip kerja laser confocal adalah menggunakan laser sebagai sumber cahayanya. Berdasarkan pencitraan mikroskop fluoresensi tradisional, perangkat pemindaian laser dan perangkat pemfokusan konjugasi ditambahkan, dan sistem dikendalikan oleh komputer untuk mengumpulkan dan memproses gambar digital.
