Prinsip, karakteristik dan aplikasi mikroskop fluoresensi
Prinsip dan karakteristik struktural mikroskop fluoresensi: mikroskop fluoresensi menggunakan sumber cahaya titik dengan efisiensi bercahaya tinggi untuk memancarkan panjang gelombang cahaya tertentu (seperti sinar ultraviolet 3650 in atau cahaya biru ungu 4200 in) melalui sistem filter sebagai eksitasi cahaya untuk merangsang fluoresensi dalam spesimen. Setelah zat memancarkan fluoresensi berbagai warna, diamati melalui perbesaran lensa objektif dan okuler. Dengan cara ini, di bawah latar belakang kontras yang kuat, meskipun fluoresensinya sangat lemah, mudah dikenali dan memiliki sensitivitas tinggi. Ini terutama digunakan untuk penelitian struktur dan fungsi sel dan komposisi kimia. Struktur dasar mikroskop fluoresensi terdiri dari mikroskop optik biasa ditambah beberapa aksesori (seperti sumber cahaya fluoresen, filter eksitasi, pembagi berkas dua warna dan filter pemblokiran, dll.). Sumber cahaya neon—umumnya menggunakan lampu merkuri bertekanan sangat tinggi (50-200W), yang dapat memancarkan cahaya dengan berbagai panjang gelombang, tetapi setiap zat fluoresen memiliki panjang gelombang eksitasi yang menghasilkan fluoresensi terkuat, sehingga filter eksitasi (Umumnya, ada filter eksitasi ultraviolet, ungu, biru dan hijau), yang hanya memungkinkan cahaya eksitasi dengan panjang gelombang tertentu melewati dan menyinari spesimen, sambil menyerap cahaya lain. Setelah setiap zat disinari oleh cahaya eksitasi, ia memancarkan fluoresensi yang terlihat dengan panjang gelombang yang lebih panjang dari panjang gelombang iradiasi dalam waktu yang sangat singkat. Fluoresensi spesifik dan umumnya lebih lemah dari cahaya eksitasi. Untuk mengamati fluoresensi tertentu, filter pemblokiran (atau penekan) diperlukan di belakang lensa objektif.
Ini memiliki dua fungsi: satu untuk menyerap dan menghalangi cahaya eksitasi memasuki lensa mata, agar tidak mengganggu fluoresensi dan merusak mata; yang lainnya adalah memilih dan membiarkan fluoresensi spesifik melewatinya, menunjukkan warna fluoresen tertentu. Kedua filter harus digunakan bersamaan.
Ada dua jenis mikroskop fluoresensi dalam hal jalur optiknya:
1. Mikroskop fluoresensi transmisi: Sumber cahaya eksitasi dilewatkan melalui bahan spesimen melalui lensa kondensor untuk membangkitkan fluoresensi. Kolektor bidang gelap biasanya digunakan, dan kolektor biasa juga dapat digunakan untuk menyesuaikan cermin sehingga cahaya eksitasi dialihkan dan dilewati ke spesimen. Ini adalah mikroskop fluoresen yang lebih tua. Keuntungannya adalah fluoresensi kuat pada perbesaran rendah, tetapi kerugiannya adalah fluoresensi berkurang dengan peningkatan pembesaran. Oleh karena itu, lebih baik mengamati bahan spesimen yang lebih besar.
2. Mikroskop epi-fluoresensi adalah jenis baru mikroskop fluoresensi yang dikembangkan di zaman modern. Perbedaannya adalah bahwa cahaya eksitasi jatuh dari lensa objektif ke permukaan spesimen, yaitu lensa objektif yang sama digunakan sebagai kondensor iluminasi dan lensa objektif untuk mengumpulkan fluoresensi. Pemisah sinar dichroic perlu ditambahkan di jalur cahaya, yang berjarak 45 derajat dari uranium cahaya. Cahaya eksitasi dipantulkan ke lensa objektif dan dikumpulkan pada sampel. Fluoresensi yang dihasilkan oleh sampel dan cahaya eksitasi yang dipantulkan oleh permukaan lensa lensa objektif dan permukaan kaca penutup memasuki lensa objektif pada saat yang sama, dan kembali ke pembagi berkas dua warna untuk membuat cahaya eksitasi Terpisah dari fluoresensi , sisa cahaya eksitasi diserap oleh filter pemblokiran. Seperti mengubah kombinasi filter eksitasi yang berbeda/pemisah sinar dua warna/filter pemblokiran, ini dapat memenuhi kebutuhan produk reaksi fluoresen yang berbeda. Keuntungan dari jenis mikroskop fluoresensi ini adalah iluminasi bidang pandangnya seragam, pencitraannya jelas, dan semakin besar perbesarannya, semakin kuat fluoresensinya.
Cara menggunakan mikroskop fluoresensi
1. Nyalakan sumber cahaya, dan lampu merkuri bertekanan sangat tinggi perlu dihangatkan selama beberapa menit untuk mencapai titik paling terang.
2. Mikroskop fluoresensi transmisi perlu memasang filter eksitasi yang diperlukan antara sumber cahaya dan kondensor, dan memasang filter pemblokiran yang sesuai di belakang lensa objektif. Mikroskop epi-fluoresensi perlu memasukkan filter eksitasi/pemisah berkas warna ganda/filter pemblokiran yang diperlukan ke dalam slot di jalur optik.
3. Amati dengan lensa perbesaran rendah, dan sesuaikan bagian tengah sumber cahaya sehingga berada di tengah seluruh titik iluminasi sesuai dengan perangkat penyesuaian berbagai model mikroskop fluoresensi.
4. Tempatkan potongan spesimen dan amati setelah pemfokusan. Perhatian harus diberikan selama penggunaan: jangan amati langsung dengan filter ujung, agar tidak menyebabkan kerusakan mata; saat mengamati spesimen dengan lensa oli, Anda harus menggunakan lensa oli khusus tanpa fluoresensi; setelah lampu merkuri bertekanan tinggi dimatikan, tidak dapat langsung dinyalakan kembali, dan perlu dilakukan pengujian. Ini dapat dimulai kembali setelah 5 menit, jika tidak maka akan menjadi tidak stabil dan mempengaruhi masa pakai lampu merkuri.
