Metode pengamatan utama mikroskop optik adalah pengamatan fluoresensi
Fenomena fluoresensi
Fluoresensi mengacu pada proses di mana zat fluoresen memancarkan cahaya dengan panjang gelombang yang lebih panjang hampir bersamaan ketika disinari dengan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (Gambar 1). Ketika cahaya dengan panjang gelombang tertentu (panjang gelombang eksitasi) menyerang molekul (seperti molekul dalam fluorofor), energi foton diserap oleh elektron molekul. Selanjutnya, transisi elektron dari keadaan dasar (S0) ke tingkat energi yang lebih tinggi, keadaan tereksitasi (S1'). Proses ini disebut eksitasi①. Elektron tetap dalam keadaan tereksitasi selama 10-9–10-8 detik, selama itu elektron kehilangan sejumlah energi ②. Dalam proses meninggalkan keadaan tereksitasi (S1) dan kembali ke keadaan dasar ③, sisa energi yang diserap selama proses eksitasi akan dilepaskan.
Waktu tinggal molekul fluoresen dalam keadaan tereksitasi adalah masa pakai fluoresensi, umumnya dalam nanodetik, yang merupakan karakteristik inheren dari molekul fluoresen itu sendiri. Teknologi pencitraan menggunakan seumur hidup fluoresensi disebut Pencitraan Seumur Hidup Fluoresensi (FLIM), yang dapat melakukan pengukuran fungsional dan akurat yang lebih mendalam selain pencitraan intensitas fluoresensi untuk mendapatkan konformasi molekuler, interaksi antarmolekul, dan lingkungan mikro molekuler. informasi yang sulit diperoleh dengan pencitraan optik konvensional.
Properti penting lain dari fluoresensi adalah pergeseran Stokes, perbedaan panjang gelombang antara puncak eksitasi dan emisi (Gambar 2). Biasanya panjang gelombang cahaya emisi lebih panjang dari panjang gelombang cahaya eksitasi. Hal ini karena setelah zat fluoresen tereksitasi dan sebelum foton dilepaskan, elektron akan kehilangan sebagian energinya melalui proses relaksasi. Zat neon dengan pergeseran Stokes yang lebih besar lebih mudah diamati di bawah mikroskop fluoresensi.
Mikroskop Fluoresensi dan Blok Filter Fluoresensi
Mikroskop fluoresensi adalah mikroskop optik yang menggunakan sifat fluoresensi untuk mengamati dan mencitrakan, dan banyak digunakan dalam biologi sel, neurobiologi, botani, mikrobiologi, patologi, genetika, dan bidang lainnya. Pencitraan fluoresensi memiliki keunggulan sensitivitas tinggi dan spesifisitas tinggi, dan sangat cocok untuk pengamatan distribusi protein spesifik, organel, dll. Dalam jaringan dan sel, studi ko-lokalisasi dan interaksi, dan pelacakan dinamika kehidupan proses seperti perubahan konsentrasi ion.
Sebagian besar molekul dalam sel tidak berpendar, dan untuk melihatnya, mereka harus diberi label berpendar. Ada banyak metode pelabelan fluoresen, yang dapat langsung diberi label (seperti menggunakan DAPI untuk melabeli DNA), atau imunostaining menggunakan sifat pengikat antigen dari antibodi, atau protein target dapat diberi label dengan protein fluoresen (seperti GFP, green protein fluoresen), atau pengikatan reversibel. pewarna sintetis (seperti Fura-2), dll.
Saat ini, mikroskop fluoresensi telah menjadi peralatan pencitraan standar dari berbagai laboratorium dan platform pencitraan, dan merupakan penolong yang baik untuk eksperimen harian kita. Mikroskop fluoresensi terutama dibagi menjadi tiga kategori: mikroskop fluoresensi tegak (cocok untuk pemotongan), mikroskop fluoresensi terbalik (cocok untuk sel hidup, dengan mempertimbangkan bagian), mikroskop stereoskopik fluoresen (cocok untuk spesimen yang lebih besar, seperti tumbuhan, ikan zebra (dewasa/ embrio), medaka, organ tikus/tikus, dll).
Blok filter fluoresensi adalah komponen inti dari pencitraan fluoresensi dalam mikroskop. Ini terdiri dari filter eksitasi, filter emisi dan pembagi berkas dichroic. Itu dipasang di roda filter, seperti Leica DMi8 yang dilengkapi dengan 6-roda filter posisi (Gambar 3). ). Mikroskop yang berbeda memiliki posisi roda yang berbeda, dan beberapa mikroskop menggunakan slide filter.
Blok filter memainkan peran penting dalam pencitraan fluoresensi: filter eksitasi memilih cahaya eksitasi untuk merangsang sampel dan memblokir panjang gelombang cahaya lainnya; cahaya yang melewati filter eksitasi melewati dichroic beamsplitter (perannya adalah untuk memantulkan cahaya eksitasi dan mentransmisikan fluoresensi), Setelah dipantulkan, difokuskan oleh lensa objektif, disinari ke sampel, dan fluoresensi yang sesuai dieksitasi menjadi memancarkan cahaya. Cahaya yang dipancarkan dikumpulkan oleh lensa objektif, melewati pembagi berkas dichroic, dan mencapai filter emisi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4: panjang gelombang eksitasi adalah 450-490nm, pembagi berkas dichroic memantulkan cahaya lebih pendek dari 510nm, mentransmisikan cahaya lebih panjang dari 510nm, dan rentang penerima pancaran cahaya adalah 520-560nm.
Filter fluoresensi yang biasa digunakan dalam mikroskop fluoresensi dapat dibagi menjadi dua jenis: long pass (LP untuk pendek) dan band pass (BP untuk pendek). Bandpass biasanya ditentukan oleh panjang gelombang pusat dan lebar interval, seperti 480/40, yang berarti bahwa cahaya dari 460-500nm dapat dilewatkan. Filter longpass, seperti 515 LP, melewatkan cahaya dengan panjang gelombang lebih panjang dari 515 nm (Gambar 5).
Zat fluoresen memiliki karakteristik kurva eksitasi (penyerapan) dan kurva emisi, puncak eksitasi adalah panjang gelombang eksitasi yang ideal (efisiensi eksitasi tinggi, yang dapat mengurangi energi cahaya eksitasi, melindungi sel dan pewarna), dan kurva emisi adalah panjang gelombang fluoresensi emisi jangkauan. Oleh karena itu, dalam percobaan, kami akan memilih panjang gelombang sedekat mungkin dengan puncak eksitasi untuk eksitasi, dan rentang penerima perlu menyertakan puncak emisi. Misalnya, puncak eksitasi Alexa Fluor 488 adalah 500nm, dan filter eksitasi 480/40 dapat dipilih dalam mikroskop fluoresensi.
Detail kubus filter dapat dilihat di perangkat lunak pencitraan mikroskop. Memahami pewarna dan menemukan filter yang paling cocok dengan sampel Anda sangat penting untuk pencitraan fluoresensi. Informasi spektral pewarna fluoresen dan protein fluoresen umumnya ditunjukkan dalam instruksi, dan juga dapat ditemukan secara online.
Selain panjang gelombang eksitasi dan emisi probe fluoresen, pemilihan blok filter juga perlu mempertimbangkan apakah ada eksitasi non-spesifik dan apakah ada warna silang untuk sampel berlabel multiwarna. Selain itu, perlu diperhatikan sumber cahaya fluorescent yang digunakan. Saat ini, sumber cahaya neon yang umum digunakan antara lain lampu merkuri, lampu halida logam, dan sumber cahaya LED yang berkembang pesat dalam beberapa tahun terakhir. Spektrum sumber cahaya fluoresen kontinu atau terputus-putus, dan energinya akan berbeda pada pita panjang gelombang yang berbeda. Sumber cahaya LED secara bertahap menjadi sumber cahaya utama mikroskop fluoresensi karena pita spektralnya yang relatif sempit, keluaran energi yang lebih stabil, umur panjang, lebih aman dan perlindungan lingkungan dan banyak keuntungan lainnya.
Selain blok filter bawaan mikroskop, ada juga roda cepat eksternal (Gambar 7). Kecepatan konversi filter yang berdekatan dengan roda cepat eksternal Leica adalah 27ms, yang dapat mewujudkan eksperimen multi-warna berkecepatan tinggi, seperti pencitraan kalsium rasio FRET dan Fura2. (Gbr. 8) dkk.
Berbagai macam teknik pencitraan mikroskop fluoresensi
Untuk memenuhi kebutuhan pencitraan fluoresensi yang berbeda, selain mikroskop fluoresensi, berbagai solusi pencitraan mikroskop fluoresensi telah dikembangkan:
Sistem pencitraan definisi tinggi bidang lebar, seperti Leica THUNDER Imager, menggunakan teknologi Clearing inovatif Leica untuk secara efisien menghilangkan sinyal interferensi bidang non-fokus selama pencitraan, menghadirkan gambar yang jelas dan keunggulan pencitraan kecepatan tinggi;
Mikroskop pemindaian laser confocal menggunakan lubang kecil untuk menghilangkan interferensi bidang non-fokus, mewujudkan pemotongan optik, dan memperoleh gambar definisi tinggi dan gambar tiga dimensi;
Mikroskop beresolusi sangat tinggi dan mikroskop nano yang menembus batas difraksi dapat mengamati struktur halus yang lebih kecil dari 200 nm;
Sistem pencitraan multifoton menggunakan prinsip eksitasi multifoton untuk pencitraan jaringan tebal dan dalam secara in vivo;
Teknologi pencitraan lembar cahaya dengan resolusi temporal dan spasial tinggi, kecepatan pencitraan cepat, resolusi tinggi, fototoksisitas rendah, sangat cocok untuk penelitian pengembangan dan pengamatan dinamis in vivo;
Pencitraan seumur hidup fluoresensi (FLIM), yang tidak dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti konsentrasi zat fluoresen, photobleaching, intensitas cahaya eksitasi, dll., dapat melakukan pengukuran fungsional dan akurat yang lebih mendalam;
Spektroskopi Korelasi Fluoresensi (FCS) dan Spektroskopi Korelasi Lintas Fluoresensi (FCCS), mengukur nomor molekul dan koefisien difusi molekul fluoresen, sehingga menganalisis konsentrasi molekul, ukuran molekul, viskositas, gerakan molekul, pengikatan/disosiasi molekul, dan sifat optik molekul;
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF), dengan resolusi sumbu z yang sangat tinggi, ideal untuk mempelajari struktur molekul dan dinamika permukaan membran sel.
