Prosedur Standar Kalibrasi Polarizer dalam Mikroskop Polarisasi
Mikroskop fluoresensi berbeda dari mikroskop optik biasa karena mikroskop ini tidak mengamati spesimen di bawah penerangan sumber cahaya biasa. Sebaliknya, ia menggunakan panjang gelombang cahaya tertentu (biasanya sinar ultraviolet, sinar biru violet) untuk merangsang zat fluoresen di dalam spesimen di bawah mikroskop, menyebabkan zat tersebut memancarkan fluoresensi. Oleh karena itu, peran sumber cahaya pada mikroskop fluoresensi bukanlah penerangan langsung, tetapi sebagai sumber energi untuk merangsang zat fluoresen di dalam spesimen. Alasan mengapa kita dapat mengamati spesimen bukan karena penerangan sumber cahaya, tetapi fenomena fluoresensi yang ditunjukkan oleh zat fluoresen di dalam spesimen setelah menyerap energi cahaya tereksitasi. Dari sini terlihat bahwa ciri utama mikroskop fluoresensi adalah sumber cahayanya dapat mensuplai cahaya eksitasi dalam jumlah besar dalam rentang panjang gelombang tertentu, sehingga zat fluoresen dalam spesimen dapat memperoleh intensitas cahaya eksitasi yang diperlukan. Pada saat yang sama, mikroskop fluoresensi harus memiliki sistem filter yang sesuai. Mikroskop fluoresensi adalah alat mendasar dalam kimia jaringan fluoresensi. Ini terdiri dari komponen utama seperti sumber cahaya tegangan ultra-tinggi, sistem filter (termasuk pelat filter eksitasi dan penekan), sistem optik, dan sistem fotografi. Ia menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu untuk merangsang spesimen dan memancarkan fluoresensi.
1. Metode eksitasi fluoresensi: Menurut rentang panjang gelombang cahaya, ada dua jenis: metode eksitasi UV (menggunakan iluminasi ultraviolet) dan metode eksitasi BV (menggunakan cahaya biru violet). Metode eksitasi UV menggunakan sinar ultraviolet dekat yang lebih pendek dari 400nm untuk eksitasi. Metode ini tidak memiliki cahaya eksitasi tampak, sehingga fluoresensi yang diamati menunjukkan fluoresensi bawaan pewarna, sehingga memudahkan untuk membedakan fluoresensi spesifik pada spesimen dari fluoresensi mandiri jaringan latar belakang.
2. Metode eksitasi BV: Melibatkan eksitasi dari ultraviolet ke cahaya biru yang berpusat pada 404nm dan 434nm. Metode ini menggunakan cahaya biru untuk menyinari spesimen, sehingga filter cut-dari sistem observasi fluoresensi harus menggunakan filter yang dapat sepenuhnya memblokir cahaya biru dan sepenuhnya melewati fluoresensi hijau dan kuning yang diperlukan. Pigmen fluoresen digunakan untuk metode antibodi fluoresen. Panjang gelombang serapan maksimum cahaya eksitasi dan panjang gelombang emisi maksimum fluoresensi relatif dekat, sehingga filter yang digunakan pada metode eksitasi BV harus menggunakan filter potong tajam. Metode ini dapat menggunakan cahaya biru sebagai cahaya eksitasi, sehingga efisiensi penyerapan pigmen fluoresen tinggi, dan gambar yang lebih terang dapat diperoleh. Kerugiannya adalah fluoresensi di bawah 500nm tidak dapat dilihat, sedangkan fluoresensi di atas 500nm membuat keseluruhan gambar tampak kuning. Dalam metode antibodi fluoresen, spesifisitas sebagian besar ditentukan oleh warna unik pigmen fluoresen, sehingga ketika membahas spesifisitas halus, kelemahan metode eksitasi BV yang disebutkan di atas sering kali mempunyai dampak yang signifikan.
