Teknik pewarnaan dan pengamatan mikroskopis mikroorganisme
1. Tujuan
1.1 Mempelajari teknik dasar apusan dan pewarnaan mikroba.
1.2 Kuasai metode pewarnaan bakteri yang sederhana.
1.3 Memahami terlebih dahulu ciri-ciri morfologi bakteri, dan memantapkan pengetahuan tentang cara menggunakan lensa minyak dan teknik pengoperasian aseptik.
2 Prinsip
Pengolesan dan pewarnaan bakteri merupakan teknik dasar dalam percobaan mikrobiologi. Sel bakteri berukuran kecil dan transparan, sehingga sulit diidentifikasi di bawah mikroskop cahaya biasa; mereka harus ternoda. Pewarna tunggal digunakan untuk mewarnai bakteri, sehingga bakteri yang diwarnai membentuk perbedaan warna yang jelas dengan latar belakangnya, sehingga morfologi dan strukturnya dapat diamati lebih jelas. Metode ini mudah dioperasikan dan cocok untuk mengamati bentuk umum sel bakteri dan susunan bakteri. Pewarna dasar biasanya digunakan untuk pewarnaan sederhana. Hal ini karena dalam larutan netral, basa atau asam lemah, sel bakteri biasanya bermuatan negatif, dan ketika pewarna basa terionisasi, bagian pewarna dari molekulnya bermuatan positif, sehingga bersifat basa. Bagian pewarna dari pewarna mudah bercampur dengan bakteri untuk mewarnainya. Sel bakteri yang diwarnai sangat kontras dengan latar belakang, membuatnya lebih mudah diidentifikasi di bawah mikroskop. Pewarna yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana antara lain metilen biru, kristal violet, fuchsin basa, dll. Ketika bakteri menguraikan gula dan menghasilkan asam, menyebabkan pH media kultur turun, muatan positif pada bakteri meningkat. Saat ini pewarna asam seperti eosin, asam fuchsin, atau merah Kongo dapat digunakan untuk pewarnaan. Bakteri harus diperbaiki sebelum pewarnaan. Tujuannya ada dua: pertama untuk membunuh bakteri dan membuat bakteri menempel pada kaca objek; yang lainnya adalah meningkatkan afinitasnya terhadap pewarna. Dua metode yang umum digunakan adalah pemanasan dan fiksasi kimia. Saat melakukan fiksasi, usahakan untuk mempertahankan bentuk asli sel.
3 bahan
3.1 Bakteri: Kultur miring agar nutrien Bacillus subtilis 12-18h, kultur miring agar nutrien Staphylococcus aureus 24 jam, kultur miring agar nutrien Escherichia coli 24 jam, kultur miring agar ragi roti.
3.2 Bahan pewarna: Pewarna biru metilen alkali Lu (atau pewarna ungu kristal amonium oksalat), pewarna fuchsin asam karbol.
3.3 Instrumen atau peralatan lainnya: mikroskop, lampu alkohol, kaca objek, lubang inokulasi, rak kaca objek, botol dua lapis (mengandung minyak cedar dan xilena), tisu lensa, garam fisiologis atau air sulingan, dll.
4. Proses: pengolesan → pengeringan → fiksasi → pewarnaan → pencucian → pengeringan → pemeriksaan mikroskopis.
5 langkah
5.1 Apusan: Ambil dua kaca objek yang bersih dan bebas minyak. Dalam kondisi steril, teteskan sedikit larutan garam normal (atau air suling) pada setiap bagian tengah kaca objek. Gunakan loop inokulasi untuk mensterilkan bakteri dari Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus dan Escherichia coli, ambil sedikit rumput bakteri di tetesan air miring, aduk rata dan oleskan ke dalam lapisan tipis. Jika Anda menggunakan apusan suspensi bakteri (atau kultur cair), Anda dapat menggunakan loop inokulasi untuk mengambil 2 hingga 3 loop dan menerapkannya langsung pada kaca objek. Berhati-hatilah untuk tidak menjatuhkan terlalu banyak garam fisiologis (air sulingan) dan menghilangkan bakteri dan mengoleskannya secara merata dan tidak terlalu kental.
5.2 Pengeringan Keringkan secara alami pada suhu kamar. Anda juga bisa memanaskannya sedikit di atas lampu alkohol dengan sisi yang dilapisi menghadap ke atas untuk mengeringkannya. Namun pastikan untuk tidak terlalu dekat dengan api, karena suhu yang terlalu tinggi akan merusak morfologi bakteri.
5.3 Fiksasi Jika digunakan pengeringan panas, fiksasi dan pengeringan digabungkan menjadi satu langkah, dan metodenya sama dengan pengeringan. Oleskan, keringkan, dan panaskan.
5.4 Pewarnaan: Letakkan kaca objek secara mendatar pada rak kaca objek, dan tambahkan 1 hingga 2 tetes larutan pewarna pada apusan (sebaiknya larutan pewarna hanya menutupi film apusan). Warnai dengan metilen biru basa Lu selama 1 hingga 2 menit, dan warnai dengan asam karbol fuchsin (atau kristal violet amonium oksalat) selama sekitar 1 menit.
5.5 Mencuci dengan air: Tuangkan larutan pewarna dan bilas perlahan dengan air keran dari salah satu ujung kaca objek sampai air yang mengalir dari noda tidak berwarna. Saat mencuci dengan air, jangan langsung mencuci permukaan yang dilapisi dengan air. Aliran air tidak boleh terlalu cepat atau terlalu besar untuk mencegah smear film terlepas.
5.6 Pengeringan: Kibaskan tetesan air pada kaca objek dan keringkan secara alami, keringkan dengan pengering rambut atau serap dengan kertas penyerap (hati-hati jangan sampai menghilangkan bakteri). 5.7 Pemeriksaan mikroskopis Setelah apusan kering, lakukan pemeriksaan mikroskopis. Apusan harus benar-benar kering sebelum dilihat dengan lensa minyak.
6 Hasil Gambarkan morfologi E. coli dan Micrococcus luteus yang diamati setelah pewarnaan tunggal.
