Teknik pewarnaan dan pengamatan mikroskopis mikroorganisme
Pewarnaan Bakteri Sederhana
1 Tujuan
1.1 Mempelajari teknik dasar apusan dan pewarnaan mikroba.
1.2 Menguasai metode pewarnaan bakteri sederhana.
1.3 Mengetahui ciri-ciri morfologi bakteri, dan memantapkan pembelajaran penggunaan oil mirror dan teknik pengoperasian aseptik.
2 Prinsip Pengolesan dan pewarnaan bakteri merupakan teknik dasar dalam percobaan mikrobiologi. Sel bakteri berukuran kecil dan transparan, tidak mudah dikenali di bawah mikroskop cahaya biasa, dan harus diwarnai. Penggunaan pewarna tunggal untuk pewarnaan bakteri, sehingga organisme yang diwarnai dan latar belakangnya membentuk perbedaan warna yang jelas, sehingga morfologi dan strukturnya dapat diamati lebih jelas. Metode ini mudah dilakukan dan cocok untuk mengamati bentuk umum organisme dan susunan bakteri. Pewarna alkali umumnya digunakan untuk pewarnaan sederhana, karena dalam larutan netral, basa, atau asam lemah, sel bakteri biasanya bermuatan negatif, dan ketika pewarna basa terionisasi, bagian pewarnaan molekulnya bermuatan positif, sehingga sebagian pewarnaan alkali pewarna dapat dengan mudah mengikat bakteri untuk membuat bakteri berwarna. Sel bakteri yang diwarnai sangat kontras dengan latar belakang dan lebih mudah dikenali di bawah mikroskop. Pewarna yang umum digunakan untuk pewarnaan sederhana antara lain biru merocyanine, kristal violet, dan senyawa basa merah. Ketika bakteri menguraikan gula menghasilkan asam sehingga pH medium menurun, muatan positif bakteri meningkat, dan kemudian dapat digunakan dalam pewarnaan merah, merah asam atau merah Kongo dan pewarna asam lainnya. Bakteri harus diperbaiki sebelum pewarnaan. Tujuannya ada dua: pertama untuk membunuh bakteri dan membuat bakteri menempel pada kaca objek; yang kedua adalah meningkatkan afinitasnya terhadap pewarna. Dua metode yang umum digunakan: pemanasan dan fiksasi kimia. Usahakan untuk mempertahankan morfologi asli sel saat melakukan fiksasi.
3 Bahan
3.1 Strain Bacillus subtilis 12-18h kultur miring agar nutrisi, Staphylococcus aureus sekitar 24 jam kultur miring agar nutrisi, Escherichia coli 24 jam kultur miring agar nutrisi, kultur miring agar ragi roti.
3.2 Pewarnaan Pewarna biru metilen basa Lue (atau pewarna kristal violet amonium oksalat), pewarna merah senyawa asam karbol.
3.3 Instrumen atau perlengkapan lainnya Mikroskop, lampu alkohol, kaca objek, cincin inokulasi, tempat kaca, botol berlapis ganda (diisi dengan minyak cedar dan xilena), kertas mikroskop, larutan garam fisiologis atau air sulingan, dll.
4 Prosedur Pengolesan → pengeringan → fiksasi → pewarnaan → pencucian → pengeringan → pemeriksaan mikroskopis.
5 Langkah
5.1 olesan Ambil dua kaca objek yang bersih dan bebas minyak, masing-masing dengan setetes kecil garam (atau air suling) di tengah kaca objek dalam kondisi aseptik, dengan cincin inokulasi untuk beroperasi secara aseptik, masing-masing, dari Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus dan Escherichia coli miring untuk mengambil sedikit lumut di setetes air, campur dan lapisi dengan film. Jika suspensi bakteri (atau kultur cair) luntur, dapat digunakan untuk menginokulasi ring pick 2 sampai 3 cincin langsung pada kaca objek. Perlu diperhatikan bahwa larutan garam (air sulingan) dan pengambilan bakteri tidak boleh terlalu banyak dan dioleskan secara merata, jangan terlalu kental.
5.2 Pengeringan Keringkan secara alami pada suhu kamar. Dapat juga dikeringkan dengan memanaskannya sedikit di atas lampu alkohol dengan sisi yang dilapisi menghadap ke atas. Namun jangan terlalu dekat dengan nyala api, karena suhu yang terlalu tinggi akan merusak morfologi bakteri.
5.3 Fiksasi Jika pengeringan panas digunakan, fiksasi dan pengeringan digabungkan menjadi satu langkah dengan cara yang sama seperti pengeringan. Oleskan, keringkan dan panaskan.
5.4 Pewarnaan Letakkan kaca objek secara mendatar pada rak kaca objek, tambahkan 1 hingga 2 tetes larutan pewarna pada apusan (larutan pewarna hanya menutupi film apusan saja sudah cukup). Warnai apusan dengan Lü's Basic Mellanox Blue selama 1~2 menit, dan dengan Carbonate Red (atau Ammonium Oxalate Crystal Violet) selama sekitar 1 menit.
5.5 Pembilasan Tuangkan larutan pewarna dan bilas perlahan dengan air keran dari salah satu ujung kaca objek sampai air yang mengalir dari noda tidak berwarna. Saat membilas, jangan biarkan air mengalir langsung untuk mencuci permukaan yang dilapisi. Aliran air tidak boleh terlalu cepat atau terlalu besar untuk menghindari copotnya smear film.
5.6 Pengeringan Kibaskan tetesan air pada kaca objek hingga kering secara alami, blow dry atau kertas penyerap dapat digunakan untuk menyerap kering (hati-hati jangan sampai menghilangkan tubuh bakteri). 5.7 Pemeriksaan mikroskopis Apusan dikeringkan dan diperiksa dengan mikroskop. Apusan harus benar-benar kering sebelum dapat diamati dengan mikroskop minyak.
6 Hasil Gambarkan morfologi E. coli dan Micrococcus garciniae setelah pewarnaan tunggal.
Noda Gram
1. Tujuan
1.1 Untuk memahami prinsip pewarnaan Gram dan pentingnya dalam klasifikasi dan identifikasi bakteri.
1.2 Mempelajari dan menguasai teknik pewarnaan Gram serta memantapkan pembelajaran penggunaan lensa minyak mikroskop cahaya.
