Persyaratan Persiapan Spesimen untuk Mikroskopi Fluoresensi
Persyaratan Persiapan Spesimen untuk Mikroskopi Fluoresensi
(1) Slide kaca
Ketebalan kaca geser harus antara 0.8-L2mm. Slide yang terlalu tebal akan menyerap lebih banyak cahaya di satu sisi dan tidak dapat memfokuskan cahaya eksitasi pada spesimen di sisi lain. Slide harus halus, seragam dalam ketebalan, dan bebas dari autofluoresensi yang jelas. Terkadang slide kuarsa digunakan.
(2) Kaca penutup
Ketebalan kaca penutup sekitar 0.17mm, mulus. Untuk memperkuat cahaya eksitasi, kaca penutup interferensi juga dapat digunakan, yaitu kaca penutup khusus yang dilapisi dengan beberapa lapisan zat (seperti magnesium fluorida) yang memiliki efek interferensi berbeda pada cahaya dengan panjang gelombang berbeda, yang dapat membuat fluoresensi halus. Cahaya eksitasi dilewatkan, dan cahaya eksitasi dipantulkan, dan cahaya eksitasi yang dipantulkan ini dapat membangkitkan spesimen.
(3) Spesimen
Irisan jaringan atau spesimen lainnya tidak boleh terlalu tebal. Jika ketebalannya terlalu tebal, sebagian besar cahaya eksitasi akan dikonsumsi di bagian bawah spesimen, sedangkan bagian atas yang diamati langsung oleh lensa objektif tidak dapat sepenuhnya tereksitasi. Selain itu, fluoresensi yang disebabkan oleh tumpang tindih sel atau pengotor, pewarnaan non-spesifik latar belakang memengaruhi penilaian.
(4) minyak cermin
Umumnya, ketika mengamati spesimen dengan mikroskop fluoresensi medan gelap dan mikroskop imersi minyak, minyak imersi harus digunakan. Yang terbaik adalah menggunakan minyak imersi non-fluorescent khusus. Gliserin juga dapat digunakan sebagai gantinya, dan parafin cair juga dapat digunakan, tetapi indeks biasnya rendah, yang berdampak kecil pada kualitas gambar.
Memahami Light Cube Mikroskop Fluoresensi
Fluoresensi adalah cahaya yang elektron dalam suatu zat menyerap energi cahaya dari keadaan berenergi rendah ke keadaan berenergi tinggi, dan kemudian melepaskan cahaya ketika kembali ke keadaan berenergi rendah. Ini adalah cahaya terpancar non-suhu — pendaran. Yaitu: zat menyerap cahaya gelombang pendek, memasuki keadaan tereksitasi, dan memancarkan cahaya gelombang panjang.
Baik itu autofluoresensi zat, pewarna fluoresen, atau protein fluoresen yang diekspresikan melalui fusi, perlu dieksitasi oleh panjang gelombang cahaya tertentu (Eksitasi). Setelah elektron bermigrasi dan kehilangan energi, mereka memancarkan cahaya dengan panjang gelombang panjang tertentu (Emisi). , yang dapat dikumpulkan oleh sistem deteksi untuk mencapai fungsi mengidentifikasi fluoresensi spesifik.
Apa itu kubus lampu neon?
Dalam pengamatan dan pencitraan mikroskop fluoresensi, cahaya eksitasi dengan panjang gelombang tertentu dan cahaya emisi panjang gelombang yang sesuai disediakan oleh kubus lampu fluoresensi, sehingga sinyal fluoresensi dapat dikumpulkan dengan mata telanjang, tampilan layar atau kamera. Oleh karena itu, kubus lampu fluoresensi menentukan apa yang dapat dideteksi Perangkat kunci dari sinyal fluoresensi, karakteristiknya meliputi EX: parameter filter panjang gelombang eksitasi, EM: parameter filter panjang gelombang emisi dan DM: parameter cermin dikotomis. Ambil kubus cahaya DAPI dari mikroskop fluoresensi terintegrasi Revolve sebagai contoh, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >Cahaya 425nm dapat ditransmisikan ke EM; Filter emisi EM digunakan untuk memisahkan fluoresensi yang dipancarkan oleh fluorofor dari elemen optik latar belakang lainnya untuk memisahkan cahaya. Filter emisi mentransmisikan cahaya pada panjang gelombang fluoresensi melalui cermin dichroic sambil memblokir semua cahaya lain yang bocor dari sumber cahaya eksitasi (dipantulkan dari sampel atau optik). Panjang gelombang cahaya yang dipancarkan lebih besar dari EM untuk diamati, yaitu hanya cahaya dalam kisaran 450±25nm yang masuk ke sistem deteksi. Pemilihan dikotomi EX, EM, dan DM yang tepat dapat membantu peneliti mencapai rasio signal-to-noise (S/N) yang lebih tinggi.
