Prinsip Mikroskop Confocal Laser (LSCM)
Mikroskop confocal laser menggunakan lubang jarum iluminasi yang ditempatkan di belakang sumber cahaya dan lubang jarum deteksi yang ditempatkan di depan detektor untuk mencapai penerangan titik dan deteksi titik. Cahaya dari sumber cahaya difokuskan pada suatu titik di bidang fokus sampel dengan cahaya yang dipancarkan melalui lubang jarum iluminasi, dan fluoresensi yang dipancarkan dari titik tersebut dicitrakan dalam lubang jarum pendeteksi, dan setiap cahaya yang dipancarkan di luar titik tersebut dihalangi oleh lubang jarum pendeteksi. Lubang jarum iluminasi dan lubang jarum pendeteksi merupakan konjugasi untuk titik yang diterangi atau terdeteksi, sehingga titik yang terdeteksi adalah titik confocal dan bidang tempat titik yang terdeteksi berada adalah bidang confocal. Komputer menampilkan titik yang terdeteksi pada layar komputer dalam bentuk titik gambar. Untuk menghasilkan gambar yang lengkap, sistem pemindaian di jalur optik memindai bidang fokus sampel, sehingga menghasilkan gambar confocal yang lengkap. Selama tahap pembawa dipindahkan ke atas dan ke bawah sepanjang sumbu Z, tingkat sampel yang baru dipindahkan ke bidang confocal, dan tingkat sampel yang baru dicitrakan pada monitor, seiring dengan sumbu Z yang terus bergerak. bergerak, gambar potongan cahaya berturut-turut dari berbagai tingkat sampel diperoleh.
Mikroskop optik tradisional menggunakan sumber cahaya lapangan, gambar setiap titik pada spesimen akan terganggu oleh difraksi atau hamburan cahaya dari titik-titik tetangga; mikroskop confocal pemindaian laser menggunakan sinar laser melalui lubang jarum yang menyala untuk membentuk sumber cahaya titik pada spesimen yang dipindai di setiap titik bidang fokus internal, spesimen pada titik iradiasi, pencitraan lubang jarum deteksi, dengan deteksi lubang jarum setelah titik tabung perkalian cahaya (PMT) atau perangkat elektrokopling dingin (cCCD) Diterima titik demi titik atau baris demi baris, gambar fluoresen dengan cepat terbentuk di layar monitor komputer. Lubang jarum iluminasi dan lubang jarum deteksi relatif terhadap bidang fokus lensa obyektif adalah konjugasi, titik pada bidang fokus sekaligus terfokus pada lubang jarum iluminasi dan lubang jarum emisi, titik di luar bidang fokus tidak akan di deteksi. lubang jarum pada pencitraan, sehingga gambar confocal yang diperoleh merupakan penampang optik spesimen, mengatasi kekurangan gambar fuzzy mikroskop biasa.
Dari prinsip dasar, mikroskop laser confocal adalah mikroskop optik modern, ini adalah mikroskop cahaya biasa dari teknologi yang melakukan perbaikan berikut.
1. Gunakan laser sebagai sumber cahaya karena monokromatisitas laser sangat baik, panjang gelombang berkas sumber cahaya sama, yang pada dasarnya menghilangkan penyimpangan kromatik.
2. Penggunaan teknologi confocal pada bidang fokus lensa objektif yang ditempatkan di tengah dengan lubang kecil pada penyekat, bidang fokus di luar menghalangi cahaya nyasar, menghilangkan aberasi bola; dan selanjutnya menghilangkan penyimpangan kromatik.
3. Mikroskop confocal laser menggunakan teknologi pemindaian titik untuk menguraikan sampel menjadi ruang dua dimensi atau tiga dimensi menjadi titik-titik yang tak terhitung jumlahnya, dengan sinar laser yang sangat kecil (sumber cahaya titik) titik demi titik, pencitraan pemindaian garis demi garis, dan kemudian melalui kombinasi mikrokomputer dari keseluruhan bidang atau gambar tiga dimensi. Mikroskop cahaya tradisional merupakan sumber cahaya lapangan dalam pencitraan satu kali, spesimen pada setiap titik gambar akan berdekatan dengan titik cahaya terdifraksi dan interferensi cahaya tersebar. Kejelasan dan ketepatan kedua gambar ini tidak dapat dibandingkan.
4. Akuisisi dan pemrosesan sinyal optik dengan komputer dan penguatan sinyal dengan tabung photomultiplier
Pada mikroskop confocal laser, komputer menggantikan mata atau kamera manusia untuk observasi dan perekaman video, dan gambar yang diperoleh didigitalkan dan dapat diproses di komputer untuk meningkatkan kejernihan gambar lagi. Selain itu, penggunaan tabung photomultiplier dapat memperkuat sinyal yang sangat lemah, sehingga meningkatkan sensitivitas secara signifikan. Sebagai hasil dari gabungan penggunaan teknologi di atas, dapat dikatakan bahwa LSCM adalah mikroskop tercanggih di dunia. Dapat dikatakan bahwa LSCM merupakan perpaduan antara teknologi produksi mikroskop, teknologi fotolistrik, teknologi komputer **, merupakan produk tak terelakkan dari perkembangan teknologi modern.
