Prinsip Mikroskopi Fluoresensi
Mikroskop fluoresensi berbeda dari mikroskop optik biasa. Alih-alih mengamati spesimen di bawah penerangan sumber cahaya biasa, mereka menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (biasanya sinar ultraviolet, cahaya biru-violet) untuk membangkitkan zat fluoresen dalam spesimen di bawah mikroskop untuk membuatnya memancarkan fluoresensi. Oleh karena itu, sumber cahaya mikroskop fluoresensi tidak berfungsi sebagai penerangan langsung, tetapi sebagai sumber energi yang membangkitkan zat fluoresen di dalam spesimen. Alasan mengapa kita dapat mengamati spesimen adalah karena iluminasi sumber cahaya, tetapi fenomena fluoresensi muncul setelah zat fluoresen dalam spesimen menyerap energi cahaya yang tereksitasi.
Dapat dilihat bahwa karakteristik mikroskop fluoresensi adalah sumber cahayanya dapat memasok sejumlah besar cahaya eksitasi dalam rentang panjang gelombang tertentu, sehingga zat fluoresen dalam spesimen yang diuji dapat memperoleh cahaya eksitasi dengan intensitas yang diperlukan. Pada saat yang sama, mikroskop fluoresensi harus memiliki sistem filter yang sesuai.
Mikroskopi fluoresensi adalah alat penting dalam histokimia imunofluoresensi. Ini terdiri dari sumber cahaya bertegangan sangat tinggi, sistem filter (termasuk pelat filter eksitasi dan penekan), sistem optik dan sistem fotografi dan komponen utama lainnya. Ini menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu untuk membangkitkan spesimen untuk memancarkan fluoresensi.
Cara membangkitkan fluoresensi: Menurut rentang panjang gelombang cahaya, dapat dibagi menjadi dua jenis: metode eksitasi UV (menggunakan metode pencahayaan ultraviolet) dan metode eksitasi BV (menggunakan cahaya biru-violet). Metode eksitasi UV menggunakan sinar ultraviolet dekat yang lebih pendek dari 400nm untuk eksitasi. Tidak ada cahaya eksitasi yang terlihat dalam metode ini, sehingga fluoresensi yang diamati menyajikan fluoresensi pewarna yang melekat, dan mudah untuk membedakan fluoresensi spesifik pada spesimen dari autofluoresensi jaringan latar belakang.
Metode eksitasi BV didasarkan pada 404nm dan 434nm untuk eksitasi dari ultraviolet ke cahaya biru. Metode ini menggunakan cahaya biru untuk menyinari spesimen, sehingga filter cut-off dari sistem pengamatan fluoresensi harus menggunakan filter yang dapat sepenuhnya memblokir cahaya biru dan sepenuhnya melewati fluoresensi hijau dan kuning yang diperlukan. Pewarna fluoresen untuk uji antibodi fluoresen. Panjang gelombang penyerapan maksimum cahaya eksitasi relatif dekat dengan panjang gelombang emisi maksimum fluoresensi, sehingga filter yang digunakan dalam metode eksitasi BV harus menggunakan filter cut-off yang tajam. Metode ini dapat menggunakan cahaya biru sebagai cahaya eksitasi, sehingga efisiensi penyerapan pigmen fluoresen lebih tinggi, dan gambar yang lebih cerah dapat diperoleh. Kerugiannya adalah fluoresensi di bawah 500nm tidak dapat dilihat, dan fluoresensi di atas 500nm membuat seluruh gambar tampak kuning. Dalam metode antibodi fluoresen, spesifisitas fluorokrom sering dinilai dari warna unik fluorokrom. Oleh karena itu, ketika membahas spesifisitas halus, kekurangan metode eksitasi BV yang disebutkan di atas sering kali memiliki pengaruh yang besar.
Singkatnya, iluminasi mikroskop fluoresensi dapat dipertimbangkan sesuai dengan tiga poin berikut sesuai dengan struktur kondensor dan panjang gelombang cahaya eksitasi.
① Dari perspektif persyaratan kontras gambar fluoresen, konsentrator medan gelap eksitasi UV digunakan untuk penerangan.
② Mempertimbangkan kecerahan gambar, filter eksitasi BV memiliki efisiensi pengamatan medan gelap tertinggi.
③Karakteristik pengamatan medan gelap filter eksitasi UV dan iluminasi konsentrator medan gelap eksitasi BV dapat dianggap sebagai antara dua metode iluminasi ini, tetapi yang pertama memiliki sifat medan gelap yang lebih kuat dan menampilkan gambar yang lebih terang. Kontrasnya kecil; yang terakhir mempertahankan sifat jalur cahaya medan gelap, sehingga gambar yang ditampilkan lebih gelap, dan kontrasnya ditingkatkan. Saat benar-benar menggunakan mikroskop fluoresensi, metode iluminasi yang paling sesuai dengan persyaratan spesimen harus digunakan untuk pengamatan.
Harus ditunjukkan bahwa meskipun kondensor medan gelap tereksitasi UV dengan kontras terbaik disinari, bagian dari cahaya eksitasi ultraviolet yang dibiaskan atau dihamburkan oleh spesimen akan memasuki lensa objektif. Autofluoresensi dapat memperburuk respons gambar. Oleh karena itu, filter penyerap UV harus digunakan di depan lensa mata sebagai filter pemutus.
