Prinsip dan Konstruksi Mikroskop Fluoresensi
Mikroskop fluoresensi menggunakan sumber cahaya titik efisiensi cahaya tinggi, yang memancarkan panjang gelombang cahaya tertentu (seperti sinar ultraviolet 3650 inci atau cahaya biru ungu 4200 inci) melalui sistem penyaringan warna sebagai cahaya eksitasi, dan menggairahkan zat fluoresen dalam sampel untuk memancarkan berbagai warna fluoresensi. Setelah itu diamati melalui perbesaran objektif dan lensa okuler. Dengan cara ini, bahkan dengan fluoresensi lemah, ia mudah dikenali dan sangat sensitif di bawah latar belakang kontras yang kuat, terutama digunakan untuk mempelajari struktur dan fungsi sel, serta komposisi kimia. Struktur dasar mikroskop fluoresensi terdiri dari mikroskop optik biasa dan beberapa aksesori (seperti sumber cahaya fluoresen, filter eksitasi, pemisah berkas bikromatik, dan filter pemblokiran, dll.). Sumber cahaya neon - biasanya menggunakan lampu merkuri bertekanan sangat tinggi (50-200W), yang dapat memancarkan cahaya dengan berbagai panjang gelombang. Namun, setiap zat fluoresen memiliki panjang gelombang cahaya eksitasi yang menghasilkan fluoresensi terkuat, sehingga filter eksitasi (biasanya filter eksitasi ultraviolet, ungu, biru, dan hijau) perlu ditambahkan agar hanya cahaya eksitasi dengan panjang gelombang tertentu yang dapat melewati dan menerangi. spesimen, sambil menyerap semua cahaya lainnya. Setelah disinari dengan cahaya tereksitasi, setiap zat memancarkan fluoresensi tampak dengan panjang gelombang yang lebih panjang dibandingkan dengan iradiasi dalam waktu yang sangat singkat. Fluoresensi memiliki kekhususan dan umumnya lebih lemah dibandingkan cahaya eksitasi. Untuk mengamati fluoresensi tertentu, filter pemblokiran (atau penekan) perlu ditambahkan di belakang lensa objektif. Ia memiliki dua fungsi: pertama, menyerap dan menghalangi cahaya eksitasi memasuki lensa mata untuk menghindari gangguan fluoresensi dan merusak mata; kedua, ia memilih dan membiarkan fluoresensi tertentu melewatinya, menampilkan warna fluoresensi tertentu. Kedua jenis filter harus dipilih untuk digunakan bersama.
Ada dua jenis mikroskop fluoresensi berdasarkan jalur optiknya:
1. Mikroskop fluoresensi transmisi: Sumber cahaya eksitasi ditransmisikan melalui bahan spesimen melalui kondensor untuk merangsang fluoresensi. Kolektor cahaya medan gelap yang umum digunakan, atau kolektor cahaya biasa, dapat digunakan untuk mengatur reflektor guna mengubah cahaya eksitasi dan cahaya samping ke spesimen. Ini adalah mikroskop fluoresensi yang relatif kuno. Keuntungannya adalah fluoresensinya kuat pada perbesaran rendah, sedangkan kelemahannya adalah fluoresensinya melemah seiring dengan peningkatan pembesaran. Oleh karena itu, lebih baik mengamati material spesimen yang lebih besar.
2. Mikroskop fluoresensi sinar jatuh Ini adalah jenis mikroskop fluoresensi baru yang dikembangkan di zaman modern. Berbeda dengan yang sebelumnya, cahaya eksitasi jatuh dari lensa objektif ke permukaan spesimen, menggunakan lensa objektif yang sama dengan kondensor iluminasi dan lensa objektif untuk mengumpulkan fluoresensi. Pemisah berkas warna ganda perlu ditambahkan ke jalur optik, yang berada pada sudut 45 derajat terhadap uranium ringan. Cahaya eksitasi dipantulkan ke lensa objektif dan terkonsentrasi pada sampel. Fluoresensi yang dihasilkan oleh sampel, serta cahaya eksitasi yang dipantulkan dari permukaan lensa objektif dan kaca penutup, masuk ke lensa objektif secara bersamaan dan kembali ke pemisah berkas dichroic, memisahkan eksitasi dan fluoresensi. Sisa eksitasi kemudian diserap oleh filter pemblokiran. Jika filter eksitasi yang berbeda/pemisah berkas warna ganda/kombinasi filter pemblokiran digunakan, filter tersebut dapat memenuhi kebutuhan produk reaksi fluoresen yang berbeda. Keuntungan dari mikroskop fluoresen ini adalah penerangan bidang penglihatannya seragam, gambarannya jelas, dan semakin besar pembesarannya, semakin kuat fluoresensinya.
