Pencitraan mikroskop multiphoton: beragam teknik untuk pencitraan neuron in vivo
Dibandingkan dengan mikroskop fluoresensi bidang lebar foton tunggal tradisional, mikroskop multifoton (MPM) memiliki fungsi pemotongan optik dan pencitraan dalam. Pada tahun 2019, Jerome Lecoq dkk. membahas teknologi MPM terkait dari tiga aspek: pencitraan neuron jauh di dalam otak, pencitraan neuron masif, dan pencitraan neuron berkecepatan tinggi.
Untuk menghubungkan aktivitas neuron dengan perilaku kompleks, biasanya diperlukan pencitraan neuron di korteks dalam, yang membutuhkan MPM untuk memiliki kemampuan pencitraan dalam. Cahaya eksitasi dan pancaran akan sangat tersebar dan diserap oleh jaringan biologis, yang merupakan faktor utama yang membatasi kedalaman pencitraan MPM. Meskipun masalah hamburan dapat diselesaikan dengan meningkatkan intensitas laser, ini akan menimbulkan masalah lain, seperti membakar sampel, pengaburan fokus, dan eksitasi Fluorescent dekat permukaan. Cara terbaik untuk meningkatkan kedalaman pencitraan MPM adalah menggunakan panjang gelombang yang lebih panjang sebagai cahaya eksitasi.
Selain itu, untuk pencitraan dua foton (2P), eksitasi fluoresensi di luar fokus dan dekat permukaan adalah dua faktor pembatas kedalaman terbesar, sedangkan untuk pencitraan tiga foton (3P), kedua masalah ini sangat berkurang, tetapi pencitraan tiga foton karena fluoresensi Penyerapan penampang kelompok jauh lebih kecil daripada 2P, sehingga urutan besarnya energi pulsa yang lebih tinggi diperlukan untuk mendapatkan sinyal fluoresensi intensitas yang sama seperti yang dieksitasi oleh 2P. Mikroskopi 3P fungsional lebih menuntut daripada mikroskop 3P struktural, yang membutuhkan pemindaian lebih cepat untuk mengambil sampel aktivitas saraf tepat waktu; energi pulsa yang lebih tinggi diperlukan untuk mengumpulkan sinyal yang cukup dalam waktu tinggal setiap piksel.
Perilaku kompleks seringkali melibatkan jaringan otak besar dengan koneksi lokal dan jarak jauh. Untuk menghubungkan aktivitas neuron dengan perilaku, perlu dilakukan pemantauan aktivitas neuron yang sangat besar dan tersebar luas pada saat yang bersamaan. Jaringan saraf di otak memproses rangsangan yang masuk dalam waktu puluhan milidetik. Untuk memahami fast neural network ini Untuk mempelajari dinamika neuron, MPM dituntut memiliki kemampuan untuk mencitrakan neuron secara cepat. Metode Fast MPM dapat dibagi menjadi teknik single-beam scanning dan teknik multi-beam scanning.
Teknologi pemindaian single-beam memungkinkan traversal jaringan saraf berkecepatan tinggi dengan field of view (FOV) yang besar
Saat menggunakan MPM untuk mencitrakan neuron, pemindaian akses acak—yaitu, sinar laser dengan cepat dipindai pada titik mana pun yang dipilih di seluruh bidang pandang—hanya dapat memindai neuron yang diinginkan, yang tidak hanya menghindari pemindaian serabut saraf yang tidak berlabel. juga mengoptimalkan waktu pemindaian sinar laser. Pemindaian akses acak (Gbr. 1) dapat dicapai dengan deflektor akustik-optik (AOD), yang bekerja dengan mengikat transduser piezoelektrik dengan sinyal frekuensi radio ke kristal yang sesuai. Gelombang akustik yang dihasilkan menginduksi kisi indeks bias periodik, Difraksi terjadi ketika sinar laser melewati kisi. Intensitas dan frekuensi gelombang suara dapat disesuaikan dengan sinyal listrik frekuensi radio untuk mengubah intensitas dan arah cahaya yang dibiaskan, sehingga pemindaian titik arbitrer horizontal satu dimensi dapat diwujudkan dengan menggunakan satu AOD, dan 3D dapat diwujudkan dengan menggunakan sepasang AOD yang dikombinasikan dengan teknologi pemindaian aksial lainnya, pemindaian akses acak. Namun, teknik ini sangat sensitif terhadap pergerakan sampel dan rentan terhadap artefak gerak. Saat ini, pemindaian raster cepat, yaitu pemindaian progresif dalam FOV, banyak digunakan karena algoritme dapat dengan mudah menyelesaikan artefak gerak.
Pencitraan dua-foton berbasis AOD dari neuron neokortikal L2/3 in vivo [2]
Ada banyak cara untuk mewujudkan pemindaian raster cepat, menggunakan cermin getar untuk pemindaian 2D cepat, menggabungkan cermin getar dan lensa elektrik yang dapat disesuaikan untuk pemindaian 3D cepat, tetapi lensa elektrik yang dapat disesuaikan tidak dapat dengan cepat fokus ke arah aksial karena keterbatasan Pengalihan inersia mekanis, yang memengaruhi kecepatan pencitraan, sekarang dapat diganti dengan modulator cahaya spasial (SLM).
Pemfokusan jarak jauh juga merupakan sarana untuk mencapai pencitraan 3D, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2. Dalam modul LSU, galvanometer pemindaian memindai secara horizontal, dan modul ASU menyertakan lensa objektif L1 dan cermin M, dan pemindaian aksial direalisasikan dengan menyesuaikan posisi M. Teknik ini tidak hanya mengoreksi aberasi optik yang diperkenalkan oleh lensa objektif utama L2, tetapi juga memungkinkan pemindaian aksial cepat. Untuk mendapatkan lebih banyak pencitraan neuron, FOV dapat diperbesar dengan menyesuaikan desain lensa objektif mikroskop, tetapi lensa objektif dengan NA besar dan FOV besar biasanya berat dan tidak dapat bergerak cepat untuk pemindaian aksial cepat, sehingga sistem FOV besar bergantung pada Telefokus , SLM dan lensa bermotor yang dapat disesuaikan.
Diagram skematis dari sistem pencitraan dua-foton fokus jarak jauh [3] Teknologi pemindaian multi-beam dapat secara bersamaan mencitrakan posisi jaringan saraf yang berbeda
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm terpisah) situs pencitraan (Gbr. 3C,D); untuk daerah yang berdekatan, biasanya menggunakan banyak sinar dari lensa objektif tunggal untuk pencitraan (Gbr. 3E, F). Teknik pemindaian multi-beam harus memberikan perhatian khusus pada masalah crosstalk antara balok eksitasi, yang dapat diselesaikan dengan metode pemisahan sumber pasca-cahaya atau metode multiplexing ruang-waktu. Metode pemisahan sumber cahaya post-hoc mengacu pada penggunaan algoritma untuk memisahkan balok untuk menghilangkan crosstalk; metode multiplexing ruang-waktu mengacu pada penggunaan simultan dari beberapa balok eksitasi, pulsa dari setiap balok tertunda dalam waktu, sehingga masing-masing balok yang dieksitasi oleh balok yang berbeda dapat dipisahkan untuk sementara. sinyal neon. Lebih banyak neuron dapat dicitrakan dengan memperkenalkan lebih banyak sinar, tetapi banyak sinar akan meningkatkan tumpang tindih waktu peluruhan fluoresensi, yang membatasi kemampuan untuk membedakan sumber sinyal; dan multiplexing berdampak negatif pada kecepatan kerja perangkat elektronik. Persyaratan tinggi; sejumlah besar sinar juga membutuhkan daya laser yang lebih tinggi untuk mempertahankan perkiraan rasio signal-to-noise dari satu sinar, yang dapat dengan mudah menyebabkan kerusakan jaringan.
Teknologi Pencitraan Area Besar
Dalam beberapa tahun terakhir, pengembangan teknologi MPM yang berbeda telah memperluas cakupan pencitraan jaringan saraf kami, memungkinkan kami untuk mencitrakan lebih banyak neuron jauh di dalam otak dengan kecepatan lebih cepat, yang telah sangat mendorong penelitian ilmu saraf dan memungkinkan kami untuk mendapatkan pemahaman yang lebih jelas. dari fungsi otak.
