Kelas Pencitraan Mikroskopis丨 Penerapan Mikroskopi Fluoresensi
Mikroskopi fluoresensi refleksi internal total (TIRFM) adalah teknik yang memanfaatkan gelombang cepat berlalu dr ingatan yang dihasilkan oleh berkas cahaya yang merambat di antara dua media indeks bias yang berbeda untuk menyelidiki permukaan sel hidup berlabel fluoresensi. Dalam praktiknya, ketika sebuah sinar laser insiden bertemu dengan antarmuka antara kaca penutup dan media berair yang mengandung sel, itu dipantulkan pada sudut kritis (refleksi internal total). Karena energi gelombang evanescent berkurang secara eksponensial dengan jarak dari kaca penutup, hanya fluorofor dalam jarak 10 nanometer dari permukaan (antara 10 dan 200 nanometer) yang dieksitasi oleh gelombang evanescent, sementara fluorofor yang lebih jauh sebagian besar tidak tereksitasi. Terpengaruh. Dengan demikian, TIRFM menghasilkan tingkat sinyal yang tinggi dari fluorophores yang terletak di dekat kaca penutup, ditumpangkan pada latar belakang yang sangat gelap, memberikan rasio signal-to-noise yang sangat baik. Keterbatasan ekstrim dari kedalaman eksitasi sangat ideal untuk mempelajari molekul tunggal atau komposisi membran dan organel dalam sel yang melekat di dekat permukaan kaca penutup (lihat Gambar 8(e)). Karena eksitasi terbatas pada daerah tipis di dekat kaca penutup, photobleaching dan fototoksisitas juga terbatas pada daerah ini, menjadikan TIRFM salah satu metode yang paling berguna untuk pengamatan jangka panjang. Teknik ini telah menjadi alat fundamental untuk mempelajari berbagai fenomena dalam sel dan biologi molekuler.
Dekonvolusi adalah algoritme yang diterapkan pada sekumpulan gambar semua fokus yang diperoleh di sepanjang sumbu optik (Z) untuk meningkatkan sinyal foton dalam tumpukan gambar untuk bidang gambar tertentu atau beberapa bidang fokus. Mikroskop harus dilengkapi dengan penggerak fokus bermotor presisi tinggi untuk menjamin perolehan gambar pada interval yang ditentukan secara tepat antara bidang fokus sampel. Dalam aplikasi tipikal (lihat Gambar 8 (f)), proses dekonvolusi digunakan untuk mengaburkan dan menghilangkan cahaya yang tidak fokus dari bidang fokus tertentu menggunakan eksitasi dan emisi fluoresensi medan lebar. Aplikasi yang paling kompleks adalah menerapkan proses dekonvolusi ke seluruh tumpukan gambar untuk menghasilkan tampilan yang diproyeksikan atau model 3D. Satu set gambar bidang lebar yang digunakan untuk dekonvolusi menangkap jumlah foton maksimum teoretis yang dipancarkan oleh sampel. Proses dekonvolusi mendistribusikan kembali intensitas foton yang "kabur" yang dipancarkan di atas dan di bawah bidang fokus kembali ke bidang aslinya. Dengan demikian, dekonvolusi menggunakan hampir semua intensitas emisi yang tersedia dan menyediakan anggaran cahaya yang optimal, menjadikan teknik ini sebagai metode pilihan untuk sampel yang sangat sensitif terhadap cahaya.
Varian dari fenomena transfer energi resonansi pada mikroskop fluoresensi, fluoresensi atau transfer energi resonansi Förster (FRET) digunakan untuk memperoleh informasi temporal dan spasial kuantitatif tentang pengikatan dan interaksi protein, lipid, enzim, dan asam nukleat dalam sel hidup. FRET dapat menggunakan teknik keadaan-konstan atau waktu-selesai, tetapi pencitraan FRET waktu-selesai memiliki keuntungan dari pemetaan jarak donor-akseptor yang lebih tepat. Mikroskop fluoresensi bidang lebar standar yang dilengkapi dengan filter eksitasi dan emisi yang sesuai dan kamera sensitif dapat digunakan untuk pencitraan FRET. Biosensor yang mengapit protein atau peptida yang sensitif terhadap lingkungan di antara dua protein fluoresen yang dapat diterapkan FRET saat ini banyak digunakan dalam biologi sel. Probe ini mudah dicitrakan di bawah mikroskop fluoresensi bidang lebar menggunakan teknik FRET emisi peka yang dikombinasikan dengan analisis rasiometrik. Selain itu, pencitraan spektral dan pemisahan linier menggunakan mikroskop confocal pemindaian laser dapat membantu memantau fenomena FRET dalam biosensor dan aplikasi protein fluoresen lainnya.
Mikroskopi pencitraan seumur hidup fluoresensi (FLIM) adalah teknik canggih yang mampu secara bersamaan merekam masa pakai fluoresensi dan lokasi spasial fluorofor di setiap lokasi dalam gambar. Metode ini menyediakan mekanisme untuk mempelajari parameter lingkungan seperti pH, konsentrasi ionik, polaritas pelarut, interaksi nonkovalen, viskositas, dan tekanan oksigen dalam sel hidup tunggal dan menyajikan data dalam susunan spasial dan temporal. Pengukuran FLIM dari masa hidup keadaan tereksitasi pada skala nanodetik tidak bergantung pada konsentrasi fluorofor lokal, efek photobleaching, dan panjang jalur (ketebalan sampel), tetapi peka terhadap reaksi keadaan tereksitasi seperti transfer energi resonansi. Faktanya, menggabungkan FLIM dengan FRET dengan memantau perubahan seumur hidup donor fluoresen sebelum dan sesudah transfer energi resonansi dianggap sebagai salah satu cara terbaik untuk mempelajari fenomena ini.
Mobilitas (koefisien difusi transversal) makromolekul berlabel berfluoresensi dan fluorofor kecil dapat ditentukan dengan pemulihan fluoresensi setelah teknik photobleaching (FRAP). Dalam FRAP, area terpilih yang sangat kecil (berdiameter beberapa mikrometer) disinari secara intens, biasanya dengan laser, untuk menghasilkan photobleaching lengkap dari fluorophore di area tersebut. Hasilnya adalah pengurangan dramatis atau penghancuran fluoresensi. Mengikuti pulsa photobleaching, laju dan tingkat pemulihan intensitas fluoresensi di daerah yang diputihkan dipantau sebagai fungsi waktu pada intensitas eksitasi rendah untuk menghasilkan informasi tentang kinetika repopulasi dan pemulihan fluorofor (Gambar 9). FRAP biasanya dilakukan dengan menggunakan EGFP atau protein fluoresen lainnya. Teknik fotoaktivasi terkait didasarkan pada fluorofor sangkar sintetik khusus atau protein fluoresen fungsional serupa yang dapat diaktifkan oleh pulsa pendek UV atau violet. Fotoaktivasi dan FRAP dapat digunakan sebagai teknik pelengkap untuk menentukan parameter mobilitas.
Dalam teknik yang berkaitan dengan FRAP, yang disebut hilangnya fluoresensi setelah photobleaching (FLIP), suatu wilayah fluoresen yang ditentukan dalam sel hidup mengalami photobleaching berulang kali dengan penyinaran yang intens. Jika semua fluorofor dapat berdifusi ke area yang sedang difoto-putihkan selama periode waktu yang diukur, ini akan mengakibatkan hilangnya sinyal fluoresen di seluruh sel. Dengan menghitung laju hilangnya fluoresensi dari seluruh sel, mobilitas difusi dari fluorofor target dapat ditentukan. Selain itu, FLIP dapat dengan mudah mengidentifikasi lokasi dan sifat dari setiap penghalang difusi antara kompartemen sel individu, seperti penghalang antara soma dan akson neuron.
Spektroskopi korelasi fluoresensi (FCS), terutama digunakan dalam mikroskop confocal pemindaian laser atau mikroskop multiphoton, adalah metode yang dirancang untuk menentukan informasi kinetik seperti laju reaksi kimia, koefisien difusi, Teknik untuk berat molekul, laju aliran, dan agregasi. Dalam FCS, volume kecil (kira-kira satu femtometer; fokus terbatas difraksi laser) diterangi dengan sinar laser terfokus untuk merekam fluktuasi intensitas autofluoresensi yang disebabkan oleh dinamika molekul fluoresen sebagai fungsi waktu dalam volume yang ditempati oleh fluoresen. molekul (Gbr. 10). Fluorofor yang relatif kecil berdifusi dengan cepat dalam volume yang diterangi, menghasilkan ledakan singkat dengan intensitas acak. Sebaliknya, kompleks yang lebih besar (fluorofor yang terikat pada makromolekul) bergerak lebih lambat, menghasilkan pola intensitas fluoresensi yang lebih lama dan lebih tahan lama.
Ketika struktur berlabel berfluoresensi padat dan tumpang tindih di wilayah tertentu sel hidup, dinamika dan distribusi spasialnya sulit untuk dianalisis. Fluorescence spot microscopy (FSM) adalah teknik yang kompatibel dengan hampir semua modalitas pencitraan yang memanfaatkan konsentrasi subunit berlabel fluoresensi yang sangat rendah, mengurangi fluoresensi di luar fokus, dan meningkatkan visibilitas struktur berlabel dan dinamikanya di daerah tebal. FSM diimplementasikan dengan memberi label hanya sebagian kecil dari keseluruhan struktur yang diminati. Dalam pengertian ini, FSM mirip dengan melakukan FCS di seluruh bidang pandang, meskipun lebih menekankan pada pola spasial daripada analisis temporal kuantitatif. Mikroskopi titik fluoresen sangat berguna dalam menentukan mobilitas dan agregasi elemen sitoskeletal seperti aktin dan mikrotubulus dalam sel hiperaktif.
Stimulated emission depletion microscopy (STED) adalah teknik super-resolusi yang muncul dengan resolusi spasial yang jauh melampaui batas difraksi, menggunakan cahaya habis berbentuk cincin untuk mengelilingi berkas cahaya eksitasi yang lebih kecil untuk mendapatkan sumbu sub-50 nm ke resolusi. Teknik ini bergantung pada eksitasi fluorofor dengan pulsa laser tersinkronisasi dan pulsa STED melingkar terkoordinasi secara spasial yang menghabiskan cahaya yang dipancarkan, menekan fluoresensi molekul tereksitasi di sekitar fokus pemindaian laser. Fluoresensi yang dihasilkan di pinggiran titik ditekan, tetapi tidak di tengah titik, sehingga secara signifikan mengurangi ukuran titik fluoresen dan secara bersamaan meningkatkan resolusi secara signifikan. STED telah terbukti menjadi alat yang berguna untuk deteksi sel hidup beresolusi tinggi. Teknik super-resolusi lain yang muncul, seperti mikroskop lokalisasi fotoaktivasi (PALM) dan mikroskop iluminasi cahaya terstruktur (SIM), juga akan menjadi alat mendasar untuk pencitraan sel hidup dalam waktu dekat.
Meningkatnya penggunaan protein fluoresen yang dikodekan secara genetik dan fluorofor sintetik canggih untuk pencitraan sel hidup membuka pintu bagi modalitas optik baru untuk memantau dinamika temporal dan hubungan spasial. Ahli mikroskop sekarang memiliki seperangkat alat lengkap untuk mengamati dan merekam data gambar dari proses seluler yang terjadi pada rentang waktu yang luas dan pada berbagai resolusi. Peristiwa yang lebih lambat dapat dengan mudah diamati dan direkam menggunakan mikroskop confocal pemindaian laser, sedangkan peristiwa kinetik yang lebih cepat dapat diperoleh dengan menggunakan teknologi cakram berputar. Selain itu, mikroskop multifoton memungkinkan pencitraan mendalam pada jaringan tebal, dan teknik refleksi internal total memungkinkan pemeriksaan permukaan membran dengan presisi confocal. Metode fluoresensi lanjutan, seperti FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM, dan STED, dapat digunakan untuk memantau interaksi protein-protein pada resolusi yang seringkali lebih baik daripada yang diizinkan oleh batas difraksi. Dengan kemajuan teknologi fluorofor, mikroskop, dan detektor, dunia yang lebih luas akan dibawa "di bawah mikroskop".
