Fitur dan Aplikasi Mikroskop Confocal Laser
Jika pada mikroskop normal bidang bayangan pengamatan diisolasi dari bidang aksial di dekatnya dengan tumpang tindih bidang fokus lensa objektif dengan detektor, pada mikroskop confocal isolasi ini dicapai dengan menyinari sampel dengan titik terbatas difraksi sebesar cahaya dan menyaring cahaya liar dengan menggunakan lubang jarum di jalur cahaya yang dikumpulkan pada fokus konjugasi titik cahaya ini untuk mencapai isolasi ini dan dengan demikian meningkatkan resolusi.
Hanya cahaya yang dipantulkan kembali dari lapisan sampel konjugat yang dapat melewati lubang jarum di jalur pengumpulan cahaya, sedangkan sisa pantulan lapisan sampel yang tidak relevan diblokir oleh lubang jarum. Ini memberikan peningkatan resolusi yang signifikan. Di bawah ini adalah perbandingan mikroskop fluoresensi multidimensi dan mikroskop confocal secara berdampingan dari sampel tebal yang sama. Ketika serangkaian gambar diambil pada bidang fokus yang berbeda, gambar yang biasa disebut sebagai "z-stack" dihasilkan, yang menunjukkan peningkatan resolusi dan kontras yang diberikan oleh mikroskop confocal dan alasan yang mendasari perolehan ini. Terlihat bahwa pemeriksaan gambar di bagian atas tumpukan di mana bidang pencitraan berada di atas jaringan menunjukkan sejumlah besar cahaya yang tersebar pada gambar fluoresensi, sedangkan gambar mikroskop confocal tampak hitam. Pengurangan PSF dalam arah aksial secara langsung berkontribusi terhadap perbedaan resolusi yang diamati pada antarmuka optik di tengah z-stack.
Pencitraan pemindaian irisan optik
Fitur lain dari mikroskop confocal pemindaian laser adalah teknik pencitraan pemindaian. Teknik iluminasi bidang lebar tradisional menerangi seluruh sampel sehingga gambar dapat ditangkap langsung oleh mata telanjang atau detektor, namun LSCM menggunakan satu atau lebih berkas cahaya terfokus untuk memindai seluruh sampel, sehingga gambar yang dihasilkan disebut gambar. irisan optik, seperti yang ditunjukkan pada diagram berikut. Perbedaan antara iluminasi bidang lebar tradisional dan iluminasi confocal pemindaian laser ditunjukkan di bawah ini.
Oleh karena itu, cara praktis mikroskop confocal modern ditunjukkan pada gambar di bawah. Cahaya eksitasi dari laser dilewatkan melalui cermin dichroic dan dipindai melalui sepasang cermin galvanometer dalam arah x dan arah y sampel, dan eksitasi (atau refleksi) sampel melewati lubang jarum ke dalam PMT. detektor untuk direkam, dan gambar pindaian yang direkam direkonstruksi oleh komputer untuk menghasilkan gambar sampel yang sebenarnya.
