Pengetahuan terkait mikroskop fluoresensi confocal
Prinsip dasar mikroskop fluoresensi confocal adalah menggunakan sumber cahaya titik untuk menyinari spesimen, membentuk titik kecil yang jelas pada bidang fokus. Fluoresensi yang dipancarkan titik setelah iradiasi dikumpulkan oleh lensa objektif dan dikirim kembali ke spektrofotometer yang terdiri dari cermin warna dua arah di sepanjang jalur iradiasi asli. Spektrofotometer mengirimkan fluoresensi langsung ke detektor. Terdapat dua lubang kecil di depan sumber cahaya dan detektor, masing-masing disebut lubang kecil penerangan dan lubang kecil pendeteksi. Dimensi geometris keduanya konsisten, sekitar 100-200nm; Dibandingkan dengan titik cahaya pada bidang fokus, keduanya bersifat konjugasi, artinya titik cahaya melewati serangkaian lensa dan pada akhirnya dapat fokus pada lubang jarum iluminasi dan lubang jarum pendeteksi secara bersamaan. Dengan cara ini, cahaya dari bidang fokus dapat menyatu dalam jangkauan lubang deteksi, sedangkan cahaya yang tersebar dari atas atau bawah bidang fokus terhalang di luar lubang deteksi dan tidak dapat dicitrakan. Dengan memindai sampel titik demi titik dengan laser, tabung pengganda foto setelah mendeteksi lubang jarum juga memperoleh gambar confocal yang sesuai dari titik cahaya demi titik, yang diubah menjadi sinyal digital dan dikirimkan ke komputer. Terakhir, gambar confocal yang jelas dari seluruh bidang fokus disintesis di layar.
Setiap gambar bidang fokus sebenarnya merupakan penampang optik suatu spesimen, yang selalu mempunyai ketebalan tertentu, disebut juga dengan penampang tipis optik. Karena intensitas cahaya pada titik fokus jauh lebih besar dibandingkan pada titik non-fokus, dan cahaya bidang non-fokus disaring oleh lubang-lubang kecil, maka kedalaman bidang sistem confocal kira-kira nol. Pemindaian sepanjang arah sumbu Z dapat mencapai tomografi optik, membentuk irisan optik dua dimensi pada titik fokus sampel yang diamati. Dengan menggabungkan pemindaian bidang XY (bidang fokus) dengan pemindaian sumbu Z (sumbu optik), gambar tiga dimensi dari sampel dapat diperoleh dengan mengumpulkan lapisan gambar dua dimensi yang berkesinambungan dan memprosesnya dengan perangkat lunak komputer khusus.
Lubang jarum pendeteksi dan lubang jarum sumber cahaya selalu terfokus pada titik yang sama, sehingga fluoresensi yang tereksitasi di luar bidang pemfokusan tidak dapat masuk ke lubang jarum pendeteksi.
Ekspresi sederhana dari prinsip kerja mikroskop confocal laser adalah menggunakan laser sebagai sumber cahaya, dan menambahkan perangkat pemindaian laser dan perangkat pemfokusan konjugasi berdasarkan pencitraan mikroskop fluoresensi tradisional. Ini adalah sistem yang dikendalikan oleh komputer untuk perolehan dan pemrosesan gambar digital.
