Pengetahuan tentang Dua{0}}Mikroskopi Fluoresensi Foton
Prinsip dasar eksitasi dua-foton adalah pada kepadatan foton yang tinggi, molekul fluoresen dapat secara bersamaan menyerap dua foton dengan panjang gelombang panjang dan memancarkan foton dengan panjang gelombang lebih pendek setelah periode-kehidupan keadaan tereksitasi yang singkat; Efeknya sama dengan menggunakan foton dengan setengah panjang gelombang panjang gelombang untuk merangsang molekul fluoresen. Dua eksitasi foton memerlukan kepadatan foton yang tinggi, dan untuk menghindari kerusakan sel, dua-mikroskop foton menggunakan-mode energi-laser pulsa terkunci yang tinggi. Laser yang dipancarkan laser ini memiliki energi puncak yang tinggi dan energi rata-rata yang rendah, dengan lebar pulsa hanya 100 femtodetik dan frekuensi hingga 80 hingga 100 megahertz. Saat menggunakan lensa objektif dengan bukaan numerik tinggi untuk memfokuskan foton laser berdenyut, kerapatan foton pada titik fokus lensa objektif adalah yang tertinggi, dan dua{11}}eksitasi foton hanya terjadi pada titik fokus lensa objektif. Oleh karena itu, mikroskop dua{13}}foton tidak memerlukan lubang jarum confocal, sehingga meningkatkan efisiensi deteksi fluoresensi.
Dalam fenomena fluoresensi umum, karena rendahnya kepadatan foton dari cahaya eksitasi, molekul fluoresen hanya dapat menyerap satu foton pada satu waktu dan kemudian memancarkan foton fluoresen lainnya melalui transisi radiasi, yang dikenal sebagai fluoresensi foton tunggal. Untuk proses eksitasi fluoresensi yang menggunakan laser sebagai sumber cahaya, fenomena fluoresensi dua-foton atau bahkan multifoton dapat terjadi. Dalam hal ini, sumber cahaya eksitasi yang digunakan memiliki intensitas dan kerapatan foton yang tinggi sehingga memenuhi persyaratan molekul fluoresen untuk menyerap dua foton secara bersamaan. Dalam proses penggunaan laser umum sebagai sumber cahaya eksitasi, kerapatan foton masih tidak mencukupi untuk menghasilkan dua-fenomena serapan foton. Biasanya, laser pulsa femtosecond digunakan, dengan daya sesaat mencapai tingkat megawatt. Oleh karena itu, panjang gelombang fluoresensi dua-foton lebih pendek dibandingkan cahaya eksitasi, setara dengan efek yang dihasilkan oleh setengah panjang gelombang eksitasi.
