Pengantar Mikroskop Fluoresensi
Mikroskopi fluoresensi adalah untuk menyinari objek yang diwarnai dengan fluorescein dengan cahaya dengan panjang gelombang pendek, sehingga tereksitasi untuk menghasilkan fluoresensi dengan panjang gelombang panjang, dan kemudian diamati. Dalam mikroskop fluoresensi, cahaya eksitasi dengan panjang gelombang tertentu harus dipilih dari cahaya iluminasi spesimen untuk menghasilkan fluoresensi, dan kemudian fluoresensi harus dipisahkan dari cahaya campuran cahaya eksitasi dan fluoresensi untuk pengamatan. Oleh karena itu, sistem filter memainkan peran yang sangat penting dalam memilih panjang gelombang tertentu. Mikroskop fluoresensi banyak digunakan dalam biologi, kedokteran, dan bidang lainnya.
1. Komponen utama mikroskop fluoresensi:
(A) Sumber cahaya: Sumber cahaya memancarkan cahaya dengan berbagai panjang gelombang (dari ultraviolet hingga inframerah). itu
(B) Sumber cahaya filter eksitasi: melalui cahaya dengan panjang gelombang tertentu yang dapat menyebabkan spesimen menghasilkan fluoresensi, sambil memblokir cahaya yang tidak berguna untuk menarik fluoresensi. itu
(C) Spesimen berpendar: umumnya diwarnai dengan pigmen berpendar. itu
(D) Filter pemblokiran: memblokir cahaya eksitasi yang tidak diserap oleh spesimen dan mentransmisikan fluoresensi secara selektif, dan beberapa panjang gelombang ditransmisikan secara selektif dalam fluoresensi.
itu
2. Klasifikasi mikroskop fluoresensi:
Mikroskop fluoresensi umumnya dibagi menjadi dua jenis: transmisi dan epi-emisi:
A. Jenis transmisi: cahaya eksitasi berasal dari bagian bawah objek yang akan diperiksa, dan kondensor adalah kondensor medan gelap, sehingga cahaya eksitasi tidak masuk ke lensa objektif, tetapi fluoresensi memasuki lensa objektif. Terang pada perbesaran rendah, tetapi gelap pada perbesaran tinggi. Sulit untuk beroperasi dalam pencelupan minyak dan pemusatan. Sangat sulit untuk menentukan rentang pencahayaan pada perbesaran rendah, tetapi bisa mendapatkan latar belakang bidang pandang yang sangat gelap. Jenis transmisi tidak digunakan untuk objek non-transparan. itu
B. Epi-type: Jenis transmisi hampir dihilangkan saat ini. Sebagian besar mikroskop fluoresensi baru adalah tipe epi. Sumber cahaya berasal dari atas objek yang akan diperiksa, dan terdapat pemecah sinar di jalur optik, sehingga cocok untuk objek transparan dan buram yang akan diperiksa. Karena lensa objektif bertindak sebagai lensa kondensor, tidak hanya mudah dioperasikan, tetapi juga dapat mencapai pencahayaan seragam di seluruh bidang pandang dari perbesaran rendah hingga perbesaran tinggi. itu
itu
3. Tindakan pencegahan untuk Fluoroskopi
A. Iradiasi cahaya eksitasi jangka panjang akan menyebabkan pelemahan dan pendinginan fluoresensi, jadi persingkat waktu pengamatan sebanyak mungkin, dan gunakan baffle untuk menutupi cahaya eksitasi saat tidak mengamati sementara. itu
B. Saat mengamati dengan lensa imersi minyak, gunakan "minyak non-pendar". itu
C. Fluoresensi hampir selalu lemah dan harus dilakukan di ruangan gelap. itu
D. Yang terbaik adalah memasang penstabil tegangan pada catu daya, jika tidak, tegangan yang tidak stabil tidak hanya akan mengurangi masa pakai lampu merkuri, tetapi juga memengaruhi efek pemeriksaan mikroskop. itu
itu
4. Penggunaan Mikroskopi Fluoresensi
1. Persyaratan persiapan spesimen mikroskop fluoresensi
A. Geser kaca
Ketebalan slide kaca harus antara 0.8 dan 1,2 mm. Slide yang terlalu tebal akan menyerap lebih banyak cahaya di satu sisi, dan di sisi lain cahaya eksitasi tidak dapat terkonsentrasi pada spesimen. Slide harus halus, seragam dalam ketebalan, dan bebas dari autofluoresensi yang jelas. Terkadang slide kaca kuarsa digunakan. itu
B. Kaca penutup
Ketebalan kaca penutup sekitar 0.17mm, mulus. Untuk memperkuat cahaya eksitasi, kaca penutup kering juga dapat digunakan, yaitu kaca penutup khusus yang dilapisi dengan beberapa lapisan zat (seperti magnesium fluorida) yang memiliki efek interferensi berbeda pada cahaya dengan panjang gelombang berbeda, yang dapat membuat fluoresensi berjalan lancar. Cahaya eksitasi dilewatkan, dan cahaya eksitasi yang dipantulkan menggairahkan spesimen. itu
C. Contoh
Irisan jaringan atau spesimen lainnya tidak boleh terlalu tebal. Jika terlalu tebal, sebagian besar cahaya eksitasi akan dikonsumsi di bagian bawah spesimen, sedangkan bagian atas yang diamati langsung oleh lensa objektif tidak dapat sepenuhnya tereksitasi. Selain itu, tumpang tindih sel atau kotoran menutupi, mempengaruhi penilaian. itu
D. Agen pemasangan
Gliserin umumnya digunakan sebagai agen pemasangan, yang tidak boleh memiliki autofluoresensi, tidak berwarna dan transparan, dan kecerahan fluoresensi lebih cerah pada pH 8.5-9.5, dan tidak mudah memudar dengan cepat. Oleh karena itu, campuran yang sama antara larutan buffer gliserol dan 0.5mol/L karbonat dengan pH 9.0 hingga 9,5 biasanya digunakan sebagai agen pemasangan. itu
e. minyak cermin
Umumnya, minyak imersi harus digunakan saat mengamati spesimen dengan mikroskop fluoresensi medan gelap dan tujuan perendaman minyak imersi. Yang terbaik adalah menggunakan minyak cermin non-fluorescent khusus, yang juga dapat diganti dengan gliserin yang disebutkan di atas, dan parafin cair juga dapat digunakan, tetapi indeks biasnya rendah, yang sedikit memengaruhi kualitas gambar.
