Perbedaan mikroskop fluoresensi dengan mikroskop konvensional
Saya baru-baru ini mencoba membuat beberapa bagian tikus yang dibekukan, dan sekarang saya perlu menggunakan mikroskop fluoresensi untuk melihat apakah virus yang saya suntikkan ada di area otak yang diinginkan. Beberapa prinsip dasar mikroskop fluoresensi perlu dipelajari secara singkat, dan saya juga akan membagikannya di sini.
Mikroskop fluoresensi menggunakan sinar ultraviolet sebagai sumber cahaya untuk menerangi benda yang diuji sehingga menyebabkan benda tersebut memancarkan sumber cahaya, kemudian mengamati benda tersebut di bawah mikroskop. Terutama digunakan untuk sel imunofluoresensi, terdiri dari sumber cahaya, sistem pelat filter, dan sistem optik untuk mengamati gambar fluoresensi sampel melalui pembesaran lensa mata dan lensa objektif. Mari kita lihat perbedaan antara mikroskop fluoresensi ini dan mikroskop optik biasa.
1. Dari segi metode pencahayaan
Metode pencahayaan pada mikroskop fluoresensi umumnya menggunakan metode sinar jatuh, artinya sumber cahaya diproyeksikan ke sampel uji melalui lensa objektif.
2. Dari segi resolusi
Mikroskop fluoresensi menggunakan sinar ultraviolet sebagai sumber cahaya, dengan panjang gelombang yang relatif pendek tetapi resolusi lebih tinggi dibandingkan mikroskop optik biasa.
3. Perbedaan pada filternya
Mikroskop fluoresensi menggunakan dua filter khusus, satu di depan sumber cahaya untuk menyaring cahaya tampak, dan yang lainnya di antara objektif dan lensa okuler untuk menyaring sinar ultraviolet, yang dapat melindungi mata.
Mikroskop fluoresensi juga merupakan jenis mikroskop optik, terutama karena panjang gelombang yang tereksitasi oleh mikroskop fluoresensi pendek, yang menyebabkan perbedaan struktur dan penggunaan mikroskop fluoresensi dan mikroskop biasa. Kebanyakan mikroskop fluoresensi memiliki fungsi yang baik dalam menangkap cahaya lemah, sehingga kemampuan pencitraannya juga baik dalam kondisi fluoresensi yang sangat lemah. Selain itu, dengan perbaikan terus-menerus pada mikroskop fluoresensi dalam beberapa tahun terakhir, kebisingan juga telah berkurang secara signifikan. Oleh karena itu, semakin banyak mikroskop fluoresensi yang diterapkan.
Pengetahuan terkait mikroskop fluoresensi dua foton
Prinsip dasar eksitasi dua foton adalah bahwa pada kepadatan foton yang tinggi, molekul fluoresen dapat secara bersamaan menyerap dua foton dengan panjang gelombang yang panjang, dan setelah periode singkat yang disebut masa tereksitasi, memancarkan foton dengan panjang gelombang yang lebih pendek; Efeknya sama dengan menggunakan foton dengan panjang gelombang setengah panjang gelombang untuk merangsang molekul fluoresen. Eksitasi dua foton memerlukan kepadatan foton yang tinggi, dan untuk menghindari kerusakan sel, laser pulsa terkunci mode energi tinggi digunakan dalam mikroskop dua foton. Laser yang dipancarkan laser jenis ini memiliki energi puncak yang tinggi dan energi rata-rata yang rendah, dengan lebar pulsa hanya 100 femtodetik dan frekuensi hingga 80 hingga 100 megahertz. Saat menggunakan objektif bukaan numerik tinggi untuk memfokuskan foton laser berdenyut, kerapatan foton pada titik fokus objektif adalah yang tertinggi, dan eksitasi dua foton hanya terjadi pada titik fokus objektif. Oleh karena itu, mikroskop dua foton tidak memerlukan lubang kecil confocal, yang meningkatkan efisiensi deteksi fluoresensi.
Dalam fenomena fluoresensi umum, karena kepadatan eksitasi foton yang rendah, molekul fluoresen hanya dapat menyerap satu foton pada saat yang sama, dan kemudian memancarkan satu foton fluoresen melalui transisi radiasi, yang disebut fluoresensi foton tunggal. Untuk proses eksitasi fluoresensi menggunakan laser sebagai sumber cahaya, fenomena fluoresensi dua foton atau bahkan multifoton dapat terjadi. Saat ini, sumber cahaya eksitasi yang digunakan berintensitas tinggi, dan kerapatan foton memenuhi persyaratan molekul fluoresen untuk menyerap dua foton secara bersamaan. Dalam proses penggunaan laser biasa sebagai sumber cahaya eksitasi, kerapatan foton masih belum cukup untuk menghasilkan fenomena serapan dua foton. Biasanya, laser pulsa femtosecond digunakan, dan daya sesaatnya dapat mencapai tingkat megawatt. Oleh karena itu, panjang gelombang fluoresensi dua foton lebih pendek daripada eksitasi, yang setara dengan efek yang dihasilkan oleh eksitasi setengah panjang gelombang eksitasi.
