Fitur dan Aplikasi Confocal Laser Microscopy
Mikroskop confocal pemindaian laser (LSCM) adalah jenis mikroskop yang dirancang berdasarkan teknologi fokus konjugat, yaitu untuk membuat sumber cahaya laser, sampel yang diuji dan detektor semuanya dalam posisi konjugat satu sama lain.
Mendasar
Dalam mikroskop umum, bidang fokus lensa objektif berimpit dengan detektor sehingga bidang gambar yang diamati diisolasi dari bidang aksial yang berdekatan, sedangkan dalam mikroskop confocal, sampel diterangi dengan menggunakan titik cahaya terbatas difraksi, dan dalam Efek isolasi ini dicapai dengan menggunakan lubang jarum di jalur cahaya pengumpulan di titik fokus konjugasi titik untuk menyaring cahaya liar guna meningkatkan resolusi.
Fitur Pencitraan
Hanya cahaya yang dipantulkan kembali dari lapisan sampel terkonjugasi yang dapat melewati lubang kecil di jalur cahaya pengumpulan, dan pantulan lapisan sampel yang tidak relevan lainnya diblokir oleh lubang kecil. Ini dapat menghasilkan peningkatan resolusi yang signifikan. Ditunjukkan di bawah ini adalah perbandingan berdampingan mikroskop fluoresensi multidimensi dan mikroskop confocal dari sampel tebal yang sama. Ketika serangkaian gambar diambil pada bidang fokus yang berbeda, apa yang biasanya disebut sebagai "tumpukan-z" dapat dihasilkan, dan gambar ini menunjukkan peningkatan resolusi dan kontras yang ditawarkan oleh mikroskop confocal dan penyebab yang mendasari peningkatan ini. Memeriksa gambar di bagian atas tumpukan dengan bidang pencitraan di atas jaringan mengungkapkan banyak cahaya yang tersebar di gambar fluoresensi, sedangkan gambar confocal tampak hitam. Pengurangan PSF dalam arah aksial ini secara langsung bertanggung jawab atas perbedaan resolusi yang diamati pada antarmuka optik di tengah z-stack.
Fitur lain dari mikroskop confocal pemindaian laser adalah bahwa itu adalah teknologi pencitraan pemindaian. Teknologi iluminasi bidang lebar tradisional menerangi seluruh sampel, sehingga gambar dapat langsung ditangkap dengan mata telanjang atau detektor, tetapi LSCM menggunakan sinar atau Beberapa sinar terfokus melewati sampel untuk pemindaian dan pencitraan, dan gambar yang dihasilkan adalah disebut bagian optik. Berikut ini menunjukkan perbedaan antara metode iluminasi medan lebar tradisional dan metode iluminasi confocal pemindaian laser.
Oleh karena itu, metode kerja praktis mikroskop confocal modern ditunjukkan pada gambar di bawah ini. Cahaya eksitasi yang dipancarkan oleh laser melewati cermin dikroik dan memindai dalam arah x dan y sampel melalui sepasang cermin getar. Eksitasi (atau pantulan) sampel Cahaya memasuki detektor PMT melalui lubang jarum dan direkam, dan gambar pemindaian yang direkam direkonstruksi oleh komputer untuk mendapatkan gambar sampel yang sebenarnya.
