Penghitungan langsung mikroorganisme dengan mikroskop
Prinsip eksperimental
Penghitungan langsung di bawah mikroskop menggunakan hemositometer merupakan metode penghitungan mikroba yang umum digunakan. Keuntungan metode ini adalah intuitif dan cepat. Tempatkan suspensi bakteri (atau suspensi spora) yang telah diencerkan dengan tepat dalam ruang hitung antara kaca objek dan kaca penutup hemositometer, dan hitung di bawah mikroskop. Karena volume ruang hitung tetap (0.1mm2), maka dapat diubah menjadi jumlah total mikroorganisme per satuan volume sesuai dengan jumlah mikroorganisme yang diamati di bawah mikroskop. Karena metode ini menghitung jumlah bakteri hidup dan mati, maka disebut juga metode penghitungan bakteri total.
Hemositometer biasanya berupa kaca objek khusus dengan empat alur yang membentuk tiga platform. Platform di tengah dibagi menjadi dua bagian oleh alur horizontal pendek. Sebuah kotak terukir pada platform di setiap sisi. Setiap grid dibagi menjadi sembilan kotak besar. Kotak besar di tengah adalah ruang hitung. Mikroorganisme dihitung di ruang hitung. Struktur papan hitung sel darah ditunjukkan pada Gambar Ⅷ-1.
Skala ruang hitung umumnya mempunyai dua spesifikasi, yang pertama adalah sebuah kotak besar dibagi menjadi 16 kotak tengah, dan setiap kotak tengah dibagi menjadi 25 kotak kecil (Gambar Ⅷ-2); yang lainnya adalah kotak besar. Kotak tersebut dibagi menjadi 25 kotak tengah, dan setiap kotak tengah dibagi menjadi 16 kotak kecil (Gambar Ⅷ-1, C). Namun apa pun jenis papan hitungnya, jumlah kotak kecil pada setiap kotak besar tetap sama, yaitu 16×25=400 kotak kecil, seperti terlihat pada Gambar Ⅷ-2.
Panjang sisi setiap persegi besar adalah 1 mm dan luas setiap persegi besar adalah 1 mm2. Setelah kaca penutup ditutup, maka tinggi antara kaca geser dan kaca penutup adalah 0.1 mm, sehingga volume ruang hitung adalah 0.1mm3.
Saat menghitung, biasanya menghitung jumlah total bakteri di lima kotak tengah, kemudian memperoleh nilai rata-rata setiap kotak tengah, lalu dikalikan dengan 16 atau 25 untuk mendapatkan jumlah total bakteri dalam kotak besar, lalu Dikonversi ke jumlah total bakteri dalam 1ml larutan bakteri.
Peralatan laboratorium
Hemositometer, mikroskop, kaca penutup, kapiler steril;
Bahan Eksperimen
Suspensi Saccharomyces cerevisiae
Prosedur percobaan (metode penghitungan langsung mikroskop mikroba)
1. pengenceran
Encerkan suspensi Saccharomyces cerevisiae dengan benar. Jika larutan bakteri tidak kental, tidak perlu diencerkan.
2. Ruang hitung mikroskopis
Sebelum menambahkan sampel, lakukan pemeriksaan mikroskopis pada ruang hitung pada pelat hitung. Jika ada kotoran perlu dibersihkan terlebih dahulu sebelum dihitung.
3. tambahkan sampel
Tutupi pelat hemositometer yang bersih dan kering dengan kaca penutup, kemudian gunakan penetes bermulut halus yang steril untuk meneteskan setetes kecil larutan Saccharomyces cerevisiae yang telah diencerkan dari tepi kaca penutup (jangan terlalu banyak), sehingga larutan bakteri dekat dengan celah di sepanjang celah tersebut. Osmosis kapiler memasuki ruang hitung dengan sendirinya, dan ruang hitung umum dapat diisi dengan cairan bakteri. Hati-hati jangan sampai ada gelembung udara.
4. hitungan mikroskop
Setelah istirahat selama 5 menit, letakkan hemositometer di atas panggung mikroskop, terlebih dahulu gunakan lensa berdaya rendah untuk mencari lokasi ruang hitung, kemudian beralih ke lensa berdaya tinggi untuk menghitung. Jika ditemukan larutan bakteri terlalu kental atau terlalu encer sebelum dihitung, maka perlu dilakukan penyesuaian kembali pengenceran sebelum dihitung. Umumnya, pengenceran sampel memerlukan sekitar 5-10 bakteri di setiap sel. Setiap ruang penghitungan memilih bakteri di 5 kotak tengah (opsional 4 kotak sudut dan tengah) untuk dihitung. Bakteri pada garis grid umumnya hanya dihitung pada garis atas dan kanan. Dalam kasus pertunasan ragi, ketika ukuran tubuh tunas mencapai setengah dari sel induk, hitunglah dua bakteri. Hitung sampel untuk menghitung kandungan bakteri dalam sampel dari nilai yang dihitung dalam dua ruang hitung.
5. Membersihkan Hemositometer
Setelah digunakan, bilas pelat penghitung sel darah pada keran dengan pancaran air, jangan dicuci dengan benda keras, dan keringkan sendiri atau dengan pengering rambut setelah dicuci. Pemeriksaan mikroskopis, amati apakah terdapat sisa bakteri atau sedimen lain pada setiap sel. Jika kurang bersih harus dicuci berkali-kali hingga bersih.
