Perbedaan dan ciri-ciri mikroskop fluoresensi dengan mikroskop optik biasa
Mikroskop fluoresensi berbeda dengan mikroskop optik biasa. Ia tidak mengamati spesimen melalui penerangan sumber cahaya biasa. Sebaliknya, ia menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (biasanya sinar ultraviolet, sinar biru-ungu) untuk merangsang bahan fluoresen dalam spesimen di bawah mikroskop, menyebabkannya memancarkan fluoresensi. Oleh karena itu, Sumber cahaya mikroskop fluoresensi tidak berfungsi sebagai penerangan langsung, tetapi sebagai sumber energi yang menggairahkan bahan fluoresen internal spesimen. Alasan mengapa kita dapat mengamati spesimen bukan karena iluminasi sumber cahayanya, melainkan fenomena fluoresensi yang disebabkan oleh bahan fluoresen pada spesimen yang menyerap energi cahaya tereksitasi. Terlihat bahwa ciri utama mikroskop fluoresensi adalah sumber cahayanya dapat menyuplai cahaya eksitasi dalam jumlah besar dalam rentang panjang gelombang tertentu, sehingga zat fluoresen pada spesimen yang diperiksa dapat memperoleh intensitas cahaya eksitasi yang diperlukan. Pada saat yang sama, mikroskop fluoresensi harus memiliki sistem filter yang sesuai. Mikroskop fluoresensi adalah alat penting untuk histokimia fluoresensi tingkat lanjut. Ini terdiri dari sumber cahaya bertekanan sangat tinggi, sistem filter (termasuk pelat filter eksitasi dan penekan), sistem optik, dan sistem fotografi. Ia menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu untuk merangsang spesimen agar memancarkan fluoresensi.
1. Cara merangsang fluoresensi: Menurut rentang panjang gelombang cahaya, dibagi menjadi dua jenis: metode eksitasi UV (menggunakan metode iluminasi ultraviolet) dan metode eksitasi BV (menggunakan cahaya biru-ungu). Metode eksitasi UV menggunakan sinar ultraviolet dekat yang lebih pendek dari 400nm untuk eksitasi. Tidak ada cahaya eksitasi yang terlihat dalam metode ini, sehingga fluoresensi yang diamati menunjukkan fluoresensi yang melekat pada pewarna, sehingga memudahkan untuk membedakan fluoresensi spesifik pada spesimen dari autofluoresensi jaringan latar belakang.
2. Metode eksitasi BV: eksitasi dari sinar ultraviolet ke cahaya biru berpusat pada 404nm dan 434nm. Metode ini menggunakan cahaya biru untuk menerangi spesimen, sehingga filter cut-off sistem observasi fluoresensi harus menggunakan filter yang dapat memblokir cahaya biru sepenuhnya dan sepenuhnya melewatkan fluoresensi hijau dan kuning yang diperlukan. Pewarna fluoresen digunakan dalam metode antibodi fluoresen. Panjang gelombang serapan maksimum cahaya eksitasi dan panjang gelombang emisi maksimum fluoresensi relatif dekat, sehingga filter yang digunakan pada metode eksitasi BV harus menggunakan filter cutoff yang tajam. Metode ini dapat menggunakan cahaya biru sebagai cahaya eksitasi, sehingga efisiensi penyerapan pigmen fluoresen lebih tinggi dan diperoleh gambar yang lebih terang. Kerugiannya adalah fluoresensi di bawah 500nm tidak dapat dilihat, sedangkan fluoresensi di atas 500nm membuat keseluruhan gambar tampak kuning. Dalam metode antibodi fluoresen, spesifisitas pewarna fluoresen sebagian besar dinilai berdasarkan warna uniknya. Oleh karena itu, ketika membahas kekhususan yang halus, kekurangan metode eksitasi BV yang disebutkan di atas seringkali memiliki dampak yang besar.
