Perbedaan Antara Mikroskop Biasa dan Mikroskop Fluoresensi
Mikroskop fluoresensi menggunakan sinar ultraviolet sebagai sumber cahaya untuk menyinari objek yang akan diperiksa, sehingga objek tersebut memancarkan cahaya, kemudian amati objek tersebut di bawah mikroskop. Ini terutama digunakan untuk sel imunofluoresensi. Ini terutama terdiri dari sumber cahaya, sistem pelat filter, dan sistem optik untuk mengamati gambar fluoresen sampel melalui perbesaran lensa mata dan lensa objektif. Mari kita lihat perbedaan antara mikroskop fluoresensi ini dan mikroskop optik biasa.
1. Dalam hal metode pencahayaan
Metode iluminasi mikroskop fluoresensi umumnya bersifat episkopik, artinya, sumber cahaya diproyeksikan pada sampel uji melalui lensa objektif.
2. Dalam hal resolusi
Mikroskop fluoresensi menggunakan sinar ultraviolet sebagai sumber cahaya. Panjang gelombangnya relatif pendek, tetapi resolusinya lebih tinggi daripada mikroskop optik biasa.
3. Perbedaan filter
Mikroskop fluoresensi menggunakan dua filter khusus, yang digunakan di depan sumber cahaya untuk menyaring cahaya tampak, dan digunakan antara lensa objektif dan lensa mata untuk menyaring sinar ultraviolet, yang dapat melindungi mata manusia.
Mikroskop fluoresensi juga merupakan sejenis mikroskop optik, terutama karena panjang gelombang yang dieksitasi oleh mikroskop fluoresensi pendek, sehingga hal ini menyebabkan perbedaan struktur dan penggunaan antara mikroskop fluoresensi dan mikroskop biasa. Sebagian besar mikroskop fluoresensi memiliki fungsi yang baik untuk menangkap cahaya lemah, jadi di bawah fluoresensi yang sangat lemah, kemampuan pencitraannya juga bagus. Ditambah dengan peningkatan berkelanjutan dari mikroskop fluoresensi dalam beberapa tahun terakhir, kebisingan juga telah sangat berkurang. Oleh karena itu semakin banyak mikroskop fluoresensi yang digunakan.
Pengetahuan tentang mikroskop fluoresensi dua foton
Prinsip dasar eksitasi dua foton adalah: dalam kasus kerapatan foton tinggi, molekul fluoresen dapat menyerap dua foton dengan panjang gelombang panjang pada saat yang sama, dan memancarkan foton dengan panjang gelombang lebih pendek setelah periode singkat yang disebut masa hidup keadaan tereksitasi. . ; efeknya sama dengan menggunakan foton yang panjang gelombangnya setengah dari panjang gelombang panjang untuk membangkitkan molekul fluoresen. Eksitasi dua foton membutuhkan kerapatan foton yang tinggi. Agar tidak merusak sel, mikroskop dua-foton menggunakan laser berdenyut mode-energi tinggi. Laser yang dipancarkan oleh laser ini memiliki energi puncak yang tinggi dan energi rata-rata yang rendah, lebar pulsanya hanya 100 femtosekon, dan frekuensinya bisa mencapai 80 hingga 100 megahertz. Saat menggunakan lensa objektif apertur numerik tinggi untuk memfokuskan foton laser berdenyut, kerapatan foton pada titik fokus lensa objektif adalah yang tertinggi, dan eksitasi dua foton hanya terjadi pada titik fokus lensa objektif, jadi mikroskop dua-foton tidak memerlukan lubang jarum confocal, yang meningkatkan efisiensi deteksi Fluoresensi.
Dalam fenomena fluoresensi umum, karena kerapatan foton cahaya eksitasi yang rendah, molekul fluoresen hanya dapat menyerap satu foton pada saat yang sama, dan kemudian memancarkan foton fluoresen melalui transisi radiasi, yang merupakan fluoresensi foton tunggal. Untuk proses eksitasi fluoresensi menggunakan laser sebagai sumber cahaya, fluoresensi dua-foton atau bahkan multi-foton dapat terjadi. Pada saat ini, intensitas sumber cahaya eksitasi yang digunakan tinggi, dan kerapatan foton memenuhi persyaratan molekul fluoresen yang menyerap dua foton pada saat yang bersamaan. Dalam proses penggunaan laser umum sebagai sumber cahaya eksitasi, kerapatan foton masih belum cukup untuk menghasilkan fenomena penyerapan dua foton. Biasanya, laser berdenyut femtosecond digunakan, dan daya seketikanya dapat mencapai urutan megawatt. Oleh karena itu, panjang gelombang fluoresensi dua foton lebih pendek dari panjang gelombang cahaya eksitasi, yang setara dengan efek yang dihasilkan oleh eksitasi pada setengah panjang gelombang eksitasi.
Mikroskop fluoresensi dua foton memiliki banyak keuntungan:
1) Cahaya dengan panjang gelombang panjang kurang terpengaruh oleh hamburan daripada cahaya dengan panjang gelombang pendek dan mudah menembus spesimen;
2) Molekul fluoresen di luar bidang fokus tidak tereksitasi, sehingga lebih banyak cahaya eksitasi dapat mencapai bidang fokus, sehingga cahaya eksitasi dapat menembus spesimen yang lebih dalam;
3) Cahaya inframerah-dekat dengan panjang gelombang panjang kurang beracun bagi sel daripada cahaya dengan panjang gelombang pendek;
4) Saat menggunakan mikroskop dua foton untuk mengamati spesimen, pemutihan foto dan fototoksisitas hanya terjadi pada bidang fokus. Oleh karena itu, mikroskop dua-foton lebih cocok daripada mikroskop foton tunggal untuk mengamati spesimen tebal, untuk mengamati sel-sel hidup, atau untuk eksperimen spot photobleaching.
Pengetahuan tentang mikroskop fluoresensi confocal
Prinsip dasar mikroskop fluoresensi confocal: sumber cahaya titik digunakan untuk menyinari spesimen, dan titik cahaya kecil yang terdefinisi dengan baik terbentuk pada bidang fokus. terdiri dari splitter. Pembagi sinar mengirimkan fluoresensi langsung ke detektor. Ada lubang jarum di depan sumber cahaya dan detektor, masing-masing disebut lubang jarum iluminasi dan lubang jarum pendeteksi. Ukuran geometris keduanya sama, sekitar 100-200nm; relatif terhadap titik cahaya pada bidang fokus, keduanya berkonjugasi, yaitu titik cahaya melewati serangkaian lensa, dan akhirnya dapat difokuskan pada lubang jarum iluminasi dan lubang jarum deteksi pada saat yang bersamaan. Dengan cara ini, cahaya dari bidang fokus dapat dikonvergensikan dalam lingkup lubang deteksi, sedangkan cahaya yang tersebar dari atas atau bawah bidang fokus diblokir di luar lubang deteksi dan tidak dapat dicitrakan. Laser memindai sampel titik demi titik, dan tabung pengganda foto setelah mendeteksi lubang jarum juga memperoleh gambar confocal dari titik titik cahaya yang sesuai, yang diubah menjadi sinyal digital dan ditransmisikan ke komputer, dan akhirnya dikumpulkan menjadi jelas gambar confocal dari seluruh bidang fokus pada layar.
Setiap gambar bidang fokus sebenarnya merupakan penampang optik dari spesimen. Penampang optik ini selalu memiliki ketebalan tertentu, disebut juga sebagai penampang tipis optik. Karena intensitas cahaya pada titik fokus jauh lebih besar daripada pada titik non-fokus, dan cahaya bidang non-fokus disaring oleh lubang jarum, kedalaman bidang sistem confocal kira-kira nol, dan pemindaian sepanjang Z -axis dapat mewujudkan tomografi optik, membentuk a Amati bagian optik dua dimensi pada titik fokus sampel. Menggabungkan pemindaian bidang XY (bidang fokus) dengan pemindaian sumbu Z (sumbu optik), gambar tiga dimensi dari sampel dapat diperoleh dengan mengumpulkan gambar dua dimensi dari lapisan kontinu dan diproses oleh perangkat lunak komputer khusus.
Artinya, lubang jarum deteksi dan lubang jarum sumber cahaya selalu terfokus pada titik yang sama, sehingga fluoresensi yang tereksitasi di luar bidang fokus tidak dapat masuk ke lubang jarum deteksi.
Ekspresi sederhana dari prinsip kerja laser confocal adalah menggunakan laser sebagai sumber cahaya, dan berdasarkan pencitraan mikroskop fluoresensi tradisional, menambahkan perangkat pemindaian laser dan perangkat pemfokusan konjugat, dan merupakan sistem untuk akuisisi gambar digital dan pengolahan melalui kontrol komputer.
