Penentuan jumlah mikroorganisme - metode penghitungan langsung mikroskop!
Pertumbuhan populasi bakteri dimanifestasikan dengan peningkatan jumlah sel atau peningkatan massa seluler. Metode penentuan jumlah sel meliputi metode penghitungan mikroskop langsung, metode penghitungan koloni lempeng, metode rasio minyak fotolistrik, metode probabilitas maksimum, dan metode filtrasi membran. Metode pengukuran materi sel meliputi penentuan berat kering sel, penentuan komponen seluler tertentu seperti kandungan nitrogen, RNA dan DNA, dan penentuan metabolit. Singkatnya, ada banyak metode untuk mengukur pertumbuhan mikroorganisme, masing-masing dengan kelebihan dan kekurangannya sendiri, dan harus dipilih sesuai dengan situasi spesifiknya. Eksperimen ini terutama memperkenalkan metode penghitungan langsung mikroskop yang biasa digunakan dalam produksi dan penelitian ilmiah.
1. Persyaratan Tujuan
1. Perjelas prinsip penghitungan sel darah.
2. Kuasai cara menghitung mikroorganisme menggunakan penghitung sel darah.
2. Prinsip dasar
Metode penghitungan langsung mikroskop adalah metode yang sederhana, cepat dan intuitif untuk menghitung secara langsung sejumlah kecil suspensi sampel yang akan diuji pada slide kaca khusus dengan luas dan volume tertentu (juga dikenal sebagai penghitung bakteri). Metode. Saat ini, penghitung bakteri yang umum digunakan di rumah dan di luar negeri adalah: papan hitung sel darah, penghitung bakteri Peteroff-Hauser dan penghitung bakteri Hawksley, dll. Mereka dapat digunakan untuk menghitung ragi, bakteri, spora jamur dan suspensi lainnya, dan prinsip dasarnya sama. Dua jenis penghitung bakteri yang terakhir memiliki total volume 0.02mm3 setelah ditutup dengan kaca penutup, dan jarak antara kaca penutup dan slide hanya 0,02mm, sehingga oli lensa objektif perendaman dapat digunakan untuk mengamati dan mengamati sel-sel kecil seperti bakteri. menghitung. Selain bakteriometer tersebut, terdapat juga metode estimasi rasio luas apusan terhadap luas lapang pandang yang diamati langsung di bawah mikroskop, yang umumnya digunakan untuk pemeriksaan bakteriologi susu. Keuntungan metode penghitungan langsung mikroskop adalah intuitif, cepat dan mudah dioperasikan. Namun, kerugian dari metode ini adalah hasil yang diukur biasanya merupakan jumlah sel mati dan sel hidup. Saat ini, ada beberapa metode untuk mengatasi kekurangan ini, seperti kombinasi pewarnaan mikrochamber bakteri yang layak (waktu singkat) dan penambahan penghambat pembelahan sel untuk mencapai tujuan penghitungan hanya bakteri yang hidup.
Dalam percobaan ini, hemositometer digunakan sebagai contoh untuk penghitungan mikroskopis langsung. Untuk penggunaan kedua jenis penghitung bakteri lainnya, silakan merujuk pada petunjuk dari masing-masing produsen. Penghitungan langsung di bawah mikroskop dengan hemositometer merupakan metode yang umum digunakan untuk menghitung mikroorganisme. Pelat penghitung adalah slide kaca khusus, di mana tiga platform dibentuk oleh empat slot; platform yang lebih luas di tengah dibagi menjadi dua bagian dengan slot melintang pendek, dan terdapat kisi-kisi di setiap sisi platform. Setiap kotak dibagi menjadi sembilan kotak besar, dan kotak besar di tengah adalah ruang hitung. Struktur pelat penghitung sel darah ditunjukkan pada Gambar l{{{{10}}}}. Skala ruang hitung umumnya memiliki dua spesifikasi, satu kotak besar dibagi menjadi 25 kotak tengah, dan setiap kotak tengah dibagi menjadi 16 kotak kecil (Gambar 15-2); yang lainnya adalah persegi besar. Bujur sangkar dibagi menjadi 16 kotak tengah, dan setiap kotak tengah dibagi menjadi 25 kotak kecil, tetapi apa pun papan hitungnya, ada 400 kotak kecil di setiap kotak besar. Panjang sisi setiap persegi besar adalah 1 mm, dan luas setiap persegi besar adalah 1 mm2. Setelah ditutup dengan kaca penutup, tinggi antara kaca penutup dan kaca slide adalah 0,1 mm, sehingga volume ruang hitung adalah 0,lmm3 (seperseribu mililiter). Gambar 15-1 Struktur papan hitung sel darah (1) Gambar 15-2 Struktur papan hitung sel darah (2) A. Tampak depan; B. Tampilan bagian memanjang; Kisi yang diperbesar, kotak besar di tengah adalah ruang hitung 1. Pelat hitung sel darah; 2. Kaca penutup; 3. Saat menghitung di ruang hitung, biasanya menghitung jumlah total bakteri dalam lima kotak, kemudian menghitung rata-rata setiap kotak, dan kalikan dengan 25 atau 16 untuk mendapatkan Jumlah total bakteri dalam kotak besar kemudian diubah menjadi jumlah total bakteri dalam 1 ml larutan bakteri. Misalkan jumlah total bakteri dalam lima kotak adalah A, dan rasio pengenceran larutan bakteri adalah B. Jika pelat penghitung dengan 25 kotak, jumlah total bakteri dalam 1 mL larutan bakteri {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(potongan) Demikian pula, jika itu adalah piring penghitung dengan 16 kotak sedang, jumlah total bakteri dalam 1mL larutan bakteri=A/ 5×16×104×B=32000A·B (potongan)
3. Peralatan
1. Bakteri
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumen atau peralatan lainnya
Hemositometer, mikroskop, kaca penutup, penetes kapiler steril.
4. Langkah-langkah pengoperasian
1. Pembuatan suspensi bakteri
Saccharomyces cerevisiae disiapkan menjadi suspensi bakteri konsentrasi yang sesuai dengan garam fisiologis steril.
2. Ruang hitung mikroskop
Sebelum menambahkan sampel, secara mikroskopis periksa ruang hitung pelat hitung. Jika ada kotoran, perlu dibersihkan dan dikeringkan sebelum dihitung.
3. Tambahkan sampel
Tutupi hemositometer yang bersih dan kering dengan kaca penutup, lalu gunakan penetes kapiler steril untuk menjatuhkan setetes kecil suspensi Saccharomyces cerevisiae yang telah dikocok dari tepi kaca penutup, dan biarkan larutan bakteri secara otomatis bergerak sepanjang celah melalui osmosis kapiler. Memasuki ruang hitung, ruang hitung umum dapat diisi dengan cairan bakteri. Saat pengambilan sampel, pertama-tama kocok larutan bakteri; saat menambahkan sampel, tidak boleh ada gelembung udara yang dihasilkan di ruang hitung.
4. Penghitungan mikroskop
Setelah menambahkan sampel, diamkan selama 5 menit, kemudian letakkan hemositometer di atas panggung mikroskop, pertama-tama temukan lokasi ruang hitung dengan mikroskop daya rendah, lalu alihkan ke mikroskop daya tinggi untuk penghitungan. Sesuaikan intensitas cahaya mikroskop dengan tepat. Untuk mikroskop yang menggunakan cermin untuk penerangan, perhatikan agar tidak menyimpang dari satu sisi cahaya, jika tidak maka tidak akan mudah melihat garis persegi ruang hitung dengan jelas di bidang penglihatan, atau hanya garis vertikal atau garis horizontal yang akan terlihat. dilihat. Jika ditemukan larutan bakteri terlalu pekat atau terlalu encer sebelum dihitung, maka perlu dilakukan pengaturan kembali pengenceran sebelum dihitung. Umumnya, pengenceran sampel membutuhkan sekitar 5 sampai 10 bakteri di setiap sel kecil. Setiap ruang hitung memilih 5 sel tengah (opsional 4 sudut dan satu sel tengah di tengah) untuk penghitungan. Sel-sel yang terletak pada garis grid umumnya hanya dihitung pada garis atas dan kanan. Dalam kasus kuncup ragi, ketika ukuran kuncup mencapai setengah dari sel induk, itu dihitung sebagai dua sel bakteri. Untuk menghitung sampel, hitung kandungan bakteri sampel dengan menghitung nilai rata-rata dari dua kamar hitung.
5. Cuci hitung sel darah
Setelah digunakan, bilas papan hitung sel darah dengan air di keran, jangan digosok dengan benda keras, dan keringkan sendiri atau dengan pengering rambut setelah dicuci. Pemeriksaan mikroskopis untuk mengamati apakah terdapat sisa bakteri atau endapan lain pada setiap sel kecil. Jika kurang bersih, harus dicuci berulang kali hingga bersih.
