Klasifikasi dan kerja mikroskop untuk penelitian sel
Mikroskop adalah alat utama untuk mengamati sel. Menurut sumber cahaya yang berbeda, dapat dibagi menjadi dua kategori: mikroskop optik dan mikroskop elektron. Yang pertama menggunakan cahaya tampak (mikroskop UV menggunakan sinar ultraviolet) sebagai sumber cahaya, sedangkan yang kedua menggunakan berkas elektron sebagai sumber cahaya.
-,Mikroskop optik
(1) Mikroskop optik biasa
Mikroskop biologis biasa terdiri dari tiga bagian, yaitu: ① sistem penerangan, termasuk sumber cahaya dan kondensor; ② sistem perbesaran optik, terdiri dari lensa objektif dan lensa mata, yang merupakan badan utama mikroskop. Untuk menghilangkan aberasi bola dan aberasi kromatik, lensa mata dan lensa objektif ③Perangkat mekanis, digunakan untuk memperbaiki material dan memfasilitasi pengamatan (Gambar 2-1).
Jelas tidaknya bayangan mikroskop tidak hanya ditentukan oleh perbesaran, tetapi juga terkait dengan resolusi mikroskop. Resolusi mengacu pada kemampuan mikroskop (atau mata manusia berjarak 25 cm dari target) untuk membedakan jarak terkecil antar objek. Ukuran resolusi ditentukan oleh Panjang gelombang dan rasio bukaan cahaya dan indeks bias medium dinyatakan dengan rumus:
Dalam rumus: n=indeks bias medium;=sudut bukaan (sudut bukaan spesimen ke bukaan lensa objektif), bukaan lensa NA=(bukaan numerik). Sudut lensa selalu kurang dari 180 derajat, sehingga nilai maksimal sina/2 harus kurang dari 1.
Indeks bias kaca yang digunakan untuk membuat lensa optik adalah 1,65 hingga 1,78, dan indeks bias media yang digunakan semakin dekat dengan kaca semakin baik. Untuk lensa objektif kering, medianya adalah udara, dan rasio apertur lensa biasanya 0.05 hingga 0,95; untuk lensa minyak, minyak cedar digunakan sebagai media, dan rasio apertur lensa bisa mendekati 1,5.
Panjang gelombang cahaya biasa adalah {{0}}nm, sehingga nilai resolusi mikroskop tidak akan kurang dari 0.2μm, dan resolusi mata manusia adalah 0,2mm, sehingga pembesaran maksimum desain mikroskop umum biasanya 1000X.
(2) Mikroskop fluoresensi
Beberapa zat dalam sel, seperti klorofil, dapat berpendar setelah disinari oleh sinar ultraviolet; beberapa zat itu sendiri tidak dapat berpendar, tetapi jika diwarnai dengan pewarna fluoresen atau antibodi fluoresen, mereka juga dapat berpendar ketika disinari oleh sinar ultraviolet, dan mikroskop fluoresensi (Gbr. 2-2, 3, 4) adalah salah satu alatnya untuk penelitian kualitatif dan kuantitatif pada zat tersebut.
Mikroskop fluoresensi dan mikroskop biasa memiliki perbedaan sebagai berikut:
1. Metode iluminasi biasanya epi-iluminasi, yaitu sumber cahaya diproyeksikan pada sampel melalui lensa objektif (Gambar 2-3);
2. Sumber cahayanya adalah sinar ultraviolet, panjang gelombangnya lebih pendek, dan resolusinya lebih tinggi dari mikroskop biasa;
3. Ada dua filter khusus, yang di depan sumber cahaya digunakan untuk menyaring cahaya tampak, dan yang di antara lensa mata dan lensa objektif digunakan untuk menyaring sinar ultraviolet untuk melindungi mata.
(3) Mikroskop confocal pemindaian laser
Mikroskop pemindaian confocal laser (mikroskop pemindaian confocal laser, Gambar 2-5, 6) menggunakan laser sebagai sumber cahaya pemindaian, dan memindai pencitraan titik demi titik, garis demi garis, permukaan demi permukaan, dan pengumpulan laser pemindaian dan fluoresensi berbagi lensa objektif, dan fokus lensa objektif adalah Titik fokus laser pemindaian juga merupakan titik objek pencitraan seketika. Karena panjang gelombang sinar laser pendek dan sinarnya sangat tipis, mikroskop pemindaian laser confocal memiliki resolusi yang lebih tinggi, yaitu sekitar 3 kali lipat dari mikroskop optik biasa. Sistem difokuskan sekali dan pemindaian dibatasi pada satu bidang sampel. Ketika kedalaman pemfokusan berbeda, gambar dari tingkat kedalaman sampel yang berbeda dapat diperoleh. Informasi gambar ini disimpan di komputer. Melalui analisis dan simulasi komputer, struktur tiga dimensi dari sampel sel dapat ditampilkan.
Mikroskopi pemindaian laser confocal dapat digunakan tidak hanya untuk mengamati morfologi sel, tetapi juga untuk analisis kuantitatif komponen biokimia intraseluler, statistik kepadatan optik, dan pengukuran morfologi sel.
(4) Mikroskop medan gelap
Mikroskop medan gelap (mikroskop medan gelap, Gambar 2-7) memiliki lembaran cahaya di tengah kondensor, sehingga cahaya iluminasi tidak langsung masuk ke lensa manusia, dan hanya cahaya yang dipantulkan dan dibiaskan oleh spesimen. diperbolehkan masuk ke lensa objektif, sehingga latar belakang bidang pandang berwarna hitam, Tepi objek cerah. Menggunakan mikroskop ini, partikel sekecil 4-200nm dapat dilihat, dan resolusinya bisa 50 kali lebih tinggi daripada mikroskop biasa.
(5) Mikroskop fase kontras
Mikroskop fasekontras (mikroskop kontras fase, Gambar 2-8, 9) oleh P. Zernike ditemukan pada tahun 1932 dan memenangkan Hadiah Nobel Fisika pada tahun 1953 untuknya. Fitur terbesar dari mikroskop ini adalah dapat mengamati spesimen dan sel hidup yang tidak ternoda.
Prinsip dasar mikroskop kontras fase adalah mengubah perbedaan jalur optik dari cahaya tampak yang melewati spesimen menjadi perbedaan amplitudo, sehingga meningkatkan kontras antara berbagai struktur dan membuat berbagai struktur terlihat jelas. Setelah melewati spesimen, cahaya dibiaskan, menyimpang dari jalur optik asli, dan tertunda 1/4λ (panjang gelombang). Perkuat, tambah atau kurangi amplitudo, tambah kontras. Dari segi struktur, mikroskop kontras fase memiliki dua fitur khusus yang berbeda dari mikroskop optik biasa:
1. Diafragma annular terletak di antara sumber cahaya dan kondensor, dan fungsinya untuk membuat cahaya yang melewati kondensor membentuk kerucut cahaya berongga dan fokus pada spesimen.
2. Pelat fase (pelat fase annular) menambahkan pelat fase yang dilapisi dengan magnesium fluorida pada lensa objektif, yang dapat menunda fase cahaya langsung atau cahaya yang dibiaskan sebesar 1/4λ. Ada dua jenis:
①Pelat fase plus: Cahaya langsung tertunda sebesar 1/4λ. Setelah dua kelompok gelombang cahaya digabungkan, gelombang cahaya ditambahkan bersama-sama, dan amplitudonya dinaikkan. Struktur spesimen lebih terang dari media sekitarnya, membentuk kontras terang (atau kontras negatif).
② Pelat fase plus B: Cahaya difraksi tertunda sebesar 1/4λ. Setelah dua set sinar digabungkan, gelombang cahaya dikurangi, dan amplitudo menjadi lebih kecil, membentuk kontras gelap (atau kontras positif), dan strukturnya lebih gelap dari medium sekitarnya.
