Perbandingan Teknik Berbeda untuk Mikroskopi Super-Resolusi
Untuk mikroskop cahaya konvensional, difraksi cahaya membatasi resolusi pencitraan hingga sekitar 250 nm. Saat ini, teknik super-resolusi dapat meningkatkan ini dengan lebih dari satu faktor 10. Teknik ini terutama dicapai melalui tiga metode: mikroskop lokalisasi molekul tunggal, termasuk mikroskop lokalisasi fotosensitif (PALM) dan mikroskop rekonstruksi optik stokastik (STORM); mikroskop iluminasi terstruktur (SIM); dan mikroskop penipisan emisi terstimulasi (STED). Bagaimana memilih teknologi super-resolusi adalah hal yang dipedulikan semua orang. "Sayangnya, tidak ada prinsip sederhana untuk memutuskan metode mana yang akan digunakan," kata Mathew Stracy, seorang peneliti pascadoktoral di Universitas Oxford, Inggris. "Masing-masing memiliki kelebihan dan kekurangannya sendiri." Ilmuwan tentu saja juga memikirkan bagaimana memilih metode yang tepat untuk proyek tertentu. "Dalam konteks bioimaging, faktor kunci yang perlu dipertimbangkan meliputi: resolusi spasial dan temporal, kepekaan terhadap kerusakan foto, kapasitas pelabelan, ketebalan sampel, dan fluoresensi latar belakang atau Fluoresensi sel autologus." Cara kerjanya Berbagai mikroskop super-resolusi bekerja dengan cara yang berbeda. Dalam kasus PALM dan STORM, hanya sebagian kecil penanda fluoresen yang tereksitasi atau terfotoaktivasi pada saat tertentu, memungkinkan pelokalan independennya dengan presisi tinggi. Melalui proses ini dengan semua label fluoresen menghasilkan gambar beresolusi super lengkap. Stefan Hell, salah satu pemenang Hadiah Nobel Kimia 2014 dan direktur Institut Kimia Biofisik Max Planck, mengatakan: "Sistem PALM/STORM relatif mudah diatur, tetapi sulit untuk diterapkan, karena sistem fluoresen kelompok harus memiliki kemampuan fotoaktivasi. Keterbatasan Kerugiannya adalah mereka perlu mendeteksi satu molekul fluoresen dalam konteks sel, dan kurang dapat diandalkan dibandingkan STED." STED menggunakan pulsa laser untuk merangsang fluorofor dan laser berbentuk cincin untuk memadamkan fluorofor, hanya menyisakan Fluoresensi berukuran nanometer perantara untuk resolusi super. Memindai seluruh sampel menghasilkan gambar. "Keuntungan dari STED adalah teknologi tombol-tekan," jelas Hell. "Ini bekerja seperti mikroskop fluoresensi confocal standar." Itu juga dapat mencitrakan sel hidup menggunakan fluorofor seperti protein fluoresen hijau atau kuning dan pewarna turunan rhodamin. Perbandingan parametrik Meskipun semua teknik super-resolusi mengungguli mikroskop cahaya konvensional dalam hal resolusi, mereka berbeda satu sama lain. SIM secara kasar menggandakan resolusi menjadi sekitar 100 nm. PALM dan STORM dapat menyelesaikan target 15 nm. Menurut Hell, STED memberikan resolusi spasial 30 nm pada sel hidup dan 15 nm pada sel tetap. Ketika datang ke aplikasi tertentu, kita juga harus mempertimbangkan rasio signal-to-noise. Dalam beberapa kasus, resolusi lebih rendah tetapi SNR lebih tinggi dapat menghasilkan gambar yang lebih baik daripada sebaliknya (resolusi lebih tinggi tetapi SNR lebih rendah). Kecepatan perolehan gambar juga sangat penting, terutama untuk sel hidup. "Semua teknik super-resolusi lebih lambat daripada teknik pencitraan fluoresensi konvensional," kata Stracy. "PALM/STORM adalah yang paling lambat, membutuhkan puluhan ribu bingkai untuk mendapatkan satu gambar, SIM membutuhkan lusinan bingkai, dan STED adalah teknologi pemindaian, sehingga kecepatan akuisisi bergantung pada ukuran bidang pandang." Selain sel hidup atau sel pencitraan tetap, beberapa ilmuwan juga ingin memahami bagaimana benda bergerak. Stracy tertarik untuk memahami dinamika sistem biologis pada sel hidup, bukan hanya gambar statis. Dia menggabungkan PALM dengan pelacakan partikel tunggal untuk menganalisis dinamika dalam sel hidup. Dengan cara ini, dia dapat langsung melacak molekul penanda saat mereka menjalankan fungsinya. Namun, ia percaya bahwa SIM tidak cocok untuk mempelajari proses dinamis ini pada tingkat molekuler, tetapi karena kecepatan perolehannya yang cepat, sangat cocok untuk mengamati dinamika struktur yang lebih besar, seperti seluruh kromosom. Hasil terbaru Pada tahun 2017, tim Hell melaporkan mikroskop super-resolusi MINFLUX di Science. Menurut Hell, metode super-resolusi ini mencapai resolusi spasial 1 nm untuk pertama kalinya. Selain itu, dapat melacak molekul individu dalam sel hidup setidaknya 100 kali lebih cepat daripada metode lainnya. Ilmuwan lain juga memuji mikroskop MINFLUX. "Aplikasi dan pendekatan baru terus dikembangkan, tetapi ada dua kemajuan yang menonjol bagi saya," kata Shechtman. Salah satunya adalah MINFLUX. "Itu menggunakan pendekatan cerdik untuk mendapatkan posisi molekul yang sangat tepat." Mengenai perkembangan menarik kedua, Shechtman menyebut WE Moerner dan rekan-rekannya di Stanford University. Moerner juga penerima Hadiah Nobel Kimia 2014. Salah satu pemenang. Untuk mengatasi keterbatasan resolusi pencitraan yang disebabkan oleh hamburan anisotropik molekul tunggal fluoresen, para ilmuwan menggunakan polarisasi eksitasi yang berbeda untuk menentukan orientasi dan posisi molekul. Selain itu, mereka telah mengembangkan permukaan pupil yang halus. Teknik-teknik ini meningkatkan kemampuan untuk melokalisasi struktur. Tentang label berpendar Dalam banyak aplikasi resolusi tinggi, label sangat penting. Ada juga beberapa perusahaan yang menyediakan produk terkait. Misalnya, Miltenyi Jerman telah bekerja sama dengan Abberior, sebuah perusahaan yang didirikan oleh Stefan Hell, untuk menyediakan layanan konjugasi antibodi khusus untuk pewarna mikroskop beresolusi super. Sejumlah perusahaan lain juga menawarkan penanda yang cocok. "Nano-Booster kami sangat kecil, hanya 1,5 kDa, dan sangat spesifik," kata Christoph Eckert, petugas pemasaran di ChromoTek. Protein ini mengikat protein fluoresen hijau dan merah (GFP dan RFP). Mereka berasal dari fragmen antibodi alpaka, yang dikenal sebagai VHH atau nanobodi, dengan sifat pengikatan yang sangat baik dan kualitas stabil tanpa variasi batch-ke-batch. Penanda ini cocok untuk berbagai teknik super-resolusi termasuk SIM, PALM, STORM dan STED. Ai-Hui Tang, asisten profesor di Fakultas Kedokteran Universitas Maryland, dan rekannya menggunakan GFP-Booster dan STORM ChromoTek untuk mengeksplorasi penyebaran informasi dalam sistem saraf. Mereka menemukan nanoclusters molekuler, yang disebut nanocolumns, di neuron presinaptik dan postinaptik. Para ilmuwan percaya bahwa struktur ini menunjukkan bahwa sistem saraf pusat menggunakan prinsip sederhana untuk menjaga dan mengatur efisiensi sinaptik. Berbagai versi pencitraan super-resolusi dan semakin banyak metode membawa para ilmuwan lebih dalam lagi ke dalam misteri biologis. Dengan menembus batas difraksi cahaya tampak, ahli biologi bahkan dapat "memantau dengan cermat" tindakan sel.
